超聲造影評價小鼠Lewis肺癌血管生成及恩度的抗腫瘤血管生成治療的療效.pdf

1、第一部分:超聲造影定量分析評價小鼠Lewis肺癌腫瘤血管的生成
　　研究背景及意義
　　腫瘤血管生成即指在腫瘤原有微血管網(wǎng)的基礎(chǔ)上通過內(nèi)皮細胞的“芽生”方式形成新生血管的過程，它是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的一個至關(guān)重要的因素。在腫瘤內(nèi)及周圍的血管生成被認為是惡性腫瘤細胞增殖的前提，這些新生血管不但能夠提供腫瘤細胞增殖所需的營養(yǎng)，也為腫瘤細胞在體內(nèi)的遠處轉(zhuǎn)移提供了通道。所以血管生成是惡性腫瘤的重要特征，它的檢出對于腫瘤的診斷、治療與預(yù)后

2、相當(dāng)重要。
　　在過去的幾年中，許多研究通過無創(chuàng)的影像學(xué)方法來評估腫瘤血管的生成，例如對比增強計算機斷層掃描(contrastenhancedcomputedtomography，CECT)、動態(tài)對比增強磁共振成像(dynamiccontrastenhancedmagneticresonanceimaging，DCE-MRI)，磁共振血管成像技術(shù)(magneticresonanceangiography，MRA)、正電子發(fā)射斷層掃

3、描(positronemissiontomography,PET)和多普勒超聲診斷技術(shù)等等。然而，以上這些方法在檢測低速血流和微小血管上，具有明顯的局限性。超聲造影明顯提高了對低速血流的檢出能力，使評價組織內(nèi)毛細血管和微血管的血流成為可能，并可提供關(guān)于腫瘤血管的詳細信息。
　　微血管密度即平均每平方毫米腫瘤面積內(nèi)的血管數(shù)，是目前評價腫瘤血管生成的公認的參考標準。然而不同血管內(nèi)皮細胞標記的微血管密度用于揭示不同腫瘤血管內(nèi)皮細胞的分化

4、程度以及結(jié)構(gòu)和功能特點。在以往的實驗研究中，較多使用CD31血管標志的微血管密度，用以評價組織的血管生成情況。由于CD31微血管密度在已分化和未分化的血管內(nèi)皮細胞中均有表達;而另一常用的血管標記物CD34則只表達于已分化的內(nèi)皮細胞中，故腫瘤血管的分化程度不同，其所代表的微血管密度亦有不同。
　　小鼠Lewis肺癌(Lewislungcarcinoma，LLC)是將傳代培養(yǎng)的Lewis肺癌細胞接種于C57/BL6小鼠的腋部皮下而成，

5、已經(jīng)多次反復(fù)應(yīng)用于實驗室的各項研究中，是較為成熟的動物瘤實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　雖然既往已有研究證實超聲造影的定量分析參數(shù)與腫瘤的微血管密度存在一定的線性相關(guān)關(guān)系，到目前為止，還未有報道關(guān)于小鼠Lewis肺癌中不同血管標記的微血管密度同超聲造影參數(shù)之間的相關(guān)性研究。
　　研究目的
　　本研究通過建立小鼠LLC的皮下移植瘤動物模型，應(yīng)用增強脈沖序列(contrastpulsesequencing，CPS)的超聲造影成像技術(shù)，結(jié)合

6、時間-強度曲線，研究并比較超聲造影的血流灌注參數(shù)與不同血管標記的微血管密度在LLC動物實驗?zāi)Ｐ椭械南嚓P(guān)性，探討超聲造影在評價腫瘤血管生成方面的應(yīng)用價值。
　　研究方法
　　建立25只小鼠LLC皮下移植瘤模型，待腫瘤大小約1.0cm左右行超聲造影檢查，應(yīng)用超聲造影定量分析軟件進行脫機分析，獲取峰值強度(peakintensity，PI)、達峰值時間(timetopeak，TTP)和到達時間（arrivaltime，AT）等超聲

7、造影定量分析參數(shù)。
　　超聲檢查結(jié)束后經(jīng)頸椎脫位處死小鼠，完整切除腫瘤，免疫組織化學(xué)法分別檢測腫瘤的CD31及CD34微血管密度的表達情況，并分別計算出微血管密度值(microvesseldensity,MVD)。
　　結(jié)果
　　1.接種后7天出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤，模型建立成功。腫瘤的平均直徑約0.9cm，最大直徑為1.3cm，大多呈橢圓形，成瘤率達100％，且無一例復(fù)種。
　　2.25例小鼠LLC的超聲造影增強模

8、式均表現(xiàn)為環(huán)狀強化，即腫瘤組織周邊部明顯強化，而中央部呈現(xiàn)低強化或無強化。在時間-強度曲線上上述LLC腫瘤均呈現(xiàn)“快進、慢出”的表現(xiàn)，即上升支陡直，迅速達峰，下降支相對較緩。
　　3.在小鼠的LLC腫瘤中，存在兩種代表血管內(nèi)皮細胞不同分化程度的血管標記物:CD31和CD34.
　　4.超聲造影的灌注參數(shù)峰值強度(PI)與CD31微血管密度呈正相關(guān)(r=0.428;P＜0.05)與CD34微血管密度無線性相關(guān)。
　　5.

9、在小鼠的LLC腫瘤中，CD31微血管密度與CD34微血管密度呈負相關(guān)(r=-0.474;P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1.本實驗成功建立了小鼠Lewis肺癌的腫瘤模型，進一步證明了該模型是研究組織腫瘤的可靠實用的動物實驗工具，并具有較好的可重復(fù)性。
　　2.在小鼠Lewis肺癌腫瘤模型中，存在兩種不同分化程度的腫瘤血管:分別是代表未分化和已分化成熟血管內(nèi)皮細胞的CD31微血管密度和只代表分化成熟的血管內(nèi)皮細胞的CD3

10、4微血管密度。
　　3.超聲定量分析參數(shù)與腫瘤微血管密度的相關(guān)性提示:超聲造影（團注法）可以通過監(jiān)測腫瘤的血流灌注參數(shù)來有效評價腫瘤血管生成;其中超聲造影參數(shù)中的峰值強度可以在一定程度上評價腫瘤未分化的血管生成，指導(dǎo)臨床應(yīng)用抗血管治療以及評估腫瘤的分級和預(yù)后上有著重要的臨床實用價值。
　　第二部分:超聲造影定量分析評價恩度對小鼠Lewis肺癌腫瘤的治療療效
　　研究背景及意義
　　抗腫瘤血管生成治療是目前治療腫瘤

11、的研究熱點和重點。由于抗腫瘤血管生成治療的靶向作用于腫瘤內(nèi)異常的新生血管或不成熟血管，其治療會引起腫瘤內(nèi)血容量、血流灌注速度及其它血流動力學(xué)指標的改變，監(jiān)測這些血流動力學(xué)指標的改變成為臨床上評價抗血管生成治療的有效指標。
　　既往多種影像學(xué)檢查方法（如CT、MRI及超聲等）都曾來評價腫瘤血管的生成和抗腫瘤血管生成治療的療效。超聲檢查尤其是彩色多普勒超聲由于具有實時、費用低、重復(fù)性好以及能直接評價腫瘤的血流灌注等優(yōu)點，在評價腫瘤血管

12、生成及抗血管生成治療中起著重要的作用。但彩色多普勒超聲對微血管的顯示及評價微血管的血流灌注有一定的局限性，近年來超聲造影更多的應(yīng)用于臨床，使對腫瘤內(nèi)微小血管內(nèi)血流的評價成為可能。在一定濃度范圍內(nèi)，超聲造影的信號強度與血液內(nèi)微泡濃度存在線性關(guān)系，故可利用時間-強度曲線軟件對超聲造影過程進行定量分析。
　　恩度(endostar)即重組人血管內(nèi)皮抑素，是一種血管生成抑制藥物，其可能作用機理是通過抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移達到抑制腫瘤

13、新生血管的生成，阻斷了腫瘤細胞的營養(yǎng)供給，從而達到抑制腫瘤的目的。臨床主要應(yīng)用于非小細胞肺癌的抗腫瘤血管生成治療。
　　由于血管生成抑制藥物主要作用于腫瘤內(nèi)的異常新生血管，治療后不僅會引起組織內(nèi)血管數(shù)目的變化，更重要的是會引起腫瘤血管的形態(tài)、以及功能的改變，上述改變往往繼發(fā)了腫瘤內(nèi)血流動力學(xué)的異常，因此監(jiān)測此異常變化可以成為臨床上評估抗血管生成治療的一個可靠手段。
　　研究目的
　　本研究擬采用Lewis肺癌荷瘤小鼠模

14、型應(yīng)用腹腔內(nèi)注射抗血管藥物恩度治療后與對照組的超聲造影血流灌注參數(shù)進行對照性研究，并將超聲造影參數(shù)與腫瘤的微血管密度進行相關(guān)性比較，旨在探討超聲造影對評價抗腫瘤血管生成藥物療效的作用。
　　研究方法
　　建立30只小鼠LLC皮下移植瘤模型，隨機分為2組，各模型自建立次日起分別經(jīng)腹腔注射生理鹽水鈉(normalsaline，NS)、恩度（5mg/kg體重），每天給藥，連續(xù)給藥14天。用藥后每天觀察兩組小鼠的一般情況，并每隔一天

15、測定小鼠腫瘤的大小。
　　末次給藥24h后行超聲造影檢查，并應(yīng)用超聲造影定量分析軟件進行脫機分析，獲取峰值強度(PI)、達峰時間(TTP)和到達時間(AT)等參數(shù)。超聲檢查結(jié)束后頸椎脫位處死小鼠，并完整切除腫瘤，免疫組織化學(xué)檢測腫瘤CD31的表達情況，并計算腫瘤的微血管密度(MVD)。
　　1.接種后7天出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤，模型建立成功，腫瘤的平均直徑約為0.9cm，最大直徑1.3cm，大多呈橢圓形，成瘤率達100％，且無一

16、例復(fù)種。
　　2.對小鼠一般情況的影響
　　用藥后生理鹽水組小鼠隨著移植瘤結(jié)節(jié)的逐漸長大，進食、飲水、活動均較前減少;恩度組小鼠進食、飲水較前無明顯變化，活動正常，持續(xù)到實驗結(jié)束。
　　實驗結(jié)束后，恩度藥物干預(yù)組小鼠LLC皮下移植瘤體積(1762.72±53.08mm3)明顯低于生理鹽水對照組（2503.72±64.78mm3），兩組之間有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。
　　3.對移植瘤微血管密度的影響
　　

17、以CD31作為血管內(nèi)皮細胞的標志物，血管內(nèi)皮細胞的胞漿被染成棕黃色。NS組及恩度組CD31MVD計數(shù)平均值分別為98.50±13.53、56.21±5.10。與NS組比較，恩度藥物干預(yù)組MVD值減低且差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　4.超聲造影軟件定量分析
　　實驗結(jié)束后，恩度治療組的峰值強度(PI)明顯低于生理鹽水對照組(p＜0.05)，其峰值強度分別為50.74±5.82及88.56±25.99。
　　5.超

18、聲造影的定量分析參數(shù)與腫瘤微血管密度之間的關(guān)系
　　實驗結(jié)束后恩度組超聲造影參數(shù)峰值強度(PI)與腫瘤的CD31微血管密度呈正相關(guān)（r=0.532，p＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1.重組人血管內(nèi)皮抑素（恩度）能夠有效抑制小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的生長。
　　2.超聲造影定量分析（團注法）可以通過監(jiān)測腫瘤的血流灌注參數(shù)的改變來評價恩度抗血管生成治療的效果。
　　3.超聲造影定量分析參數(shù)中的峰值強度可以有