星形細(xì)胞瘤血管生成擬態(tài)的形態(tài)觀察及恩度抑制腫瘤與腫瘤血管形成相關(guān)分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移需要充分的血液供應(yīng)。新生血管生成(neovascularization)主要包括血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)兩種方式,它們均依賴于內(nèi)皮細(xì)胞。前者指中胚層來(lái)源的血管母細(xì)胞(hemangioblast)原位分化成內(nèi)皮細(xì)胞,并生長(zhǎng)形成循環(huán)血管;后者則指在已有的血管網(wǎng)基礎(chǔ)上,內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)分裂、芽生、擴(kuò)展、延伸等機(jī)制形成新的血管網(wǎng)。血管發(fā)生和血管新生都參與了腫瘤新生血管生

2、成過(guò)程,因而針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抗血管治療成為臨床治療許多惡性腫瘤的一個(gè)重要策略,并取得了良好效果。然而總是存在一些耐藥病例,表明惡性腫瘤中可能存在不依賴內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成方式。
　　 1999年,美國(guó)Iowas大學(xué)Maniotis等根據(jù)對(duì)人眼葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)的研究,發(fā)現(xiàn)了一種與經(jīng)典的腫瘤血管生成途徑完全不同、不依賴內(nèi)皮細(xì)胞的全新腫瘤血管模式,稱之為“血管生成擬態(tài)(ivasculogenic mimicry,VM)”。腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程

3、中,某些惡性細(xì)胞可表達(dá)多潛能未分化的胚胎樣細(xì)胞表型,通過(guò)模擬內(nèi)皮細(xì)胞并與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用形成運(yùn)輸血液的管道系統(tǒng),從而與宿主血管相連使腫瘤獲得血液供應(yīng),這種模擬胚胎期血管形成的過(guò)程稱為“血管生成擬態(tài)”。VM有以下特征:(1)血管壁主要由腫瘤細(xì)胞而非內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成,有一層基底膜樣物;(2)內(nèi)皮特異標(biāo)記的免疫組化染色(FⅧRag、CD31、CD34、KDR等)呈陰性反應(yīng),有PAS染色陽(yáng)性物質(zhì);(3)紅細(xì)胞漏出和微血栓形成的情況少見,血管周圍很

4、少見到腫瘤中心性壞死現(xiàn)象;(4)僅存在于高侵襲性腫瘤,而非低侵襲性腫瘤或良性腫瘤。
　　 血管生成擬態(tài)現(xiàn)象對(duì)腫瘤生物學(xué)行為具有十分重要的意義。一方面,經(jīng)血管生成擬態(tài)方式形成的血管沒有內(nèi)皮細(xì)胞的屏障作用,從理論上講可以為腫瘤的生長(zhǎng)提供良好的灌注;另一方面,血管生成擬態(tài)的發(fā)生需要破壞組織形成管道,加之缺乏內(nèi)皮細(xì)胞的屏障作用,管壁外襯的腫瘤細(xì)胞在釋放蛋白水解酶并溶解基底膜后有直接進(jìn)入血流的可能,因此更有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。VM是對(duì)傳

5、統(tǒng)血管生成理論的重要補(bǔ)充,不僅解釋了血管生成理論難以說(shuō)明的一些問(wèn)題,而且為-抑制腫瘤血液供應(yīng)提供了新的思路和方法。隨后的研究發(fā)現(xiàn),血管生成擬態(tài)不僅存在于眼葡萄膜黑色素瘤中,而且同樣存在于皮膚黑色素瘤、卵巢癌、炎性乳癌、胃癌、肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤中;VM不僅與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有關(guān),而且和疾病的治療預(yù)后密切相關(guān)。
　　 星形細(xì)胞瘤(astrocytoma)是成人腦組織最常見的原發(fā)惡性腫瘤,是人體血管化程度最高的腫

6、瘤之一,有明顯的血管增殖和生成特性,微血管增殖是星形細(xì)胞瘤分級(jí)的重要標(biāo)準(zhǔn)。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma)是星形細(xì)胞瘤的最高級(jí)別(WHOⅣ),是已知血管化程度最高的非血管源性惡性腫瘤。針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抗血管藥物治療已經(jīng)在約50％的星形細(xì)胞瘤患者取得效果,但是臨床耐藥病例卻逐漸增多。為了更有效的進(jìn)行臨床治療,深入研究星形細(xì)胞瘤血管生成的分子機(jī)制是十分必要的。以往研究已經(jīng)證實(shí),血管發(fā)生和血管新生都參與了星形細(xì)胞瘤血管生成,但血管生成擬

7、態(tài)是否參與了星形細(xì)胞瘤的血管生成,其與星形細(xì)胞瘤的治療預(yù)后的關(guān)系如何,迄今為止還沒有系統(tǒng)的研究。
　　 1997年Folkman教授在血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了一種抗血管新生內(nèi)源性糖蛋白,稱之為內(nèi)皮抑素(endostatin)。內(nèi)皮抑素具有強(qiáng)烈的抗血管新生和抗腫瘤作用,很快被應(yīng)用于臨床治療惡性治腫瘤。然而由于生產(chǎn)提純非常困難,內(nèi)皮抑素的臨床應(yīng)用受到限制。恩度(Endostar)是一種重組人內(nèi)皮抑素,由中華人民共和國(guó)食品

8、藥品監(jiān)督局2005年批準(zhǔn)用于臨床治療非小細(xì)胞肺癌,我國(guó)學(xué)者在血管內(nèi)皮抑素的結(jié)構(gòu)上增加了9個(gè)氨基酸,成功解決了重組人內(nèi)皮抑素穩(wěn)定性差的問(wèn)題。臨床應(yīng)用及相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)恩度具有很強(qiáng)的抗血管新生和抗腫瘤作用,但恩度是否對(duì)血管生成擬態(tài)有抑制作用未見報(bào)道。
　　 目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)中我們首先用人組織切片雙重染色觀察星形細(xì)胞瘤是否存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象并分析其臨床意義;其次,我們?cè)贛atrigel上三維培養(yǎng)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251、

9、SHG44,體外觀察星形細(xì)胞瘤細(xì)胞形成VM的能力;最后,研究恩度在體外對(duì)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及VM的抑制作用,并利用Real time RT-PCR和Western blot技術(shù)探討相關(guān)的分子機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一、臨床病理標(biāo)本收集
　　 收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科1998-2006年診斷的星形細(xì)胞瘤病例,選擇臨床資料完整的石蠟標(biāo)本共80例。其中彌漫型星形細(xì)胞瘤(WHOⅡ)30例,間變型

10、星形細(xì)胞瘤(WHOⅢ)20例,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHOⅣ)30例。
　　 二、免疫組化和PAS雙重染色
　　 為了更直觀的觀察VM結(jié)構(gòu),本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了CD34與PAS、GFAP與PAS兩種雙重染色方案。首先按照間接法進(jìn)行CD34或GFAP免疫組化染色,當(dāng)DAB顯色后,進(jìn)行PAS染色,再蘇木素復(fù)染,封片。
　　 三、組織切片形態(tài)觀察及VM的確定
　　 光學(xué)顯微鏡下觀察雙重染色的組織切片。PAS陽(yáng)性CD34陰性內(nèi)有

11、紅細(xì)胞的管腔認(rèn)定為VM血管,每張石蠟切片5個(gè)隨機(jī)視野(100x)有超過(guò)30％的VM血管定義為該患者存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象。
　　 四、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 共4種細(xì)胞,星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251、SHG44傳代培養(yǎng),人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)、大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte)原代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中,在3

12、7℃、5％CO2、飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。
　　 五、細(xì)胞三維培養(yǎng)
　　 Matrigel膠4℃過(guò)夜解凍,冰上操作,吸取Matrigel膠至96孔培養(yǎng)板,50μl/孔,注意勿產(chǎn)生氣泡,置37℃培養(yǎng)箱中孵育1h,使其凝固。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述4種細(xì)胞,取細(xì)胞懸液100μl加入已鋪膠的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)/孔,培養(yǎng)24h、48h,在倒置相差顯微鏡下(100x)對(duì)細(xì)胞小管形成情況進(jìn)行圖像觀

13、察及采集。
　　 六、MTT測(cè)定細(xì)胞增殖情況
　　 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251、SHG44,取細(xì)胞懸液100μl加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔約含1×104個(gè)細(xì)胞,分別用不同濃度的恩度(0,125,250,500,and1000μg/ml)作用12h、24h、36h,MTT法測(cè)定細(xì)胞的增殖情況。
　　 七、Transwell測(cè)定細(xì)胞侵襲能力
　　 將用Matrigel包被好的Transwell小室放

14、入24孔板中,下室加入含20％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液250μl,加入已稀釋的濃度為2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml的恩度工作液250μl,使下室培養(yǎng)體系恩度終濃度分別為1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml:取細(xì)胞懸液50μl加入上室,細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/孔,在上室加入恩度至終濃度為1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml,濃度與下室藥物濃度相對(duì)應(yīng),培養(yǎng)24h。用棉簽擦去微孔膜

15、上層的Matrigel膠及細(xì)胞;甲醇室溫下固定15min,蘇木素染液染色40 min,蒸餾水沖洗。在倒置相差顯微鏡下(200x)對(duì)遷移至微孔膜下層的細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　 八、恩度對(duì)U251體外形成VM的作用
　　 在上述(七)相同的培養(yǎng)條件下,加入已稀釋的濃度為2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml的恩度工作液100μl,使恩度終濃度分別為1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml,同時(shí)設(shè)置對(duì)照

16、孔,即只接種細(xì)胞,不加入恩度藥物,每個(gè)樣本重復(fù)3次。置37℃、5％CO2、飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在倒置相差顯微鏡下(100x)對(duì)細(xì)胞小管形成情況進(jìn)行圖像觀察及采集。
　　 九、Real time RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞VE-Cadherin和EphA2 mRNA的表達(dá)
　　 收集待測(cè)細(xì)胞,進(jìn)行RNA抽提并測(cè)定OD260/OD280,反轉(zhuǎn)錄后按下列條件在熒光定量PCR儀上擴(kuò)增:95℃,90sec,1個(gè)循環(huán)

17、:95℃,5sec、58℃,30sec和72℃,4min,45個(gè)循環(huán)。最后計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
　　 十、Western blot檢測(cè)細(xì)胞VE-Cadherin和EphA2蛋白的表達(dá)
　　 收集待測(cè)細(xì)胞,各組細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)提取后,-70℃保存?zhèn)溆谩Ｅ渲茲饪s膠及分離膠,上樣后120V電泳1-2h,NC轉(zhuǎn)膜2-2.5h,5％脫脂奶粉封閉1h,加一抗(1:500),4℃過(guò)夜,二抗(1:1000)室溫孵

18、育1h,ECL發(fā)光,測(cè)定灰度值。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、星形細(xì)胞瘤組織中VM形態(tài)
　　 雙重染色的星形細(xì)胞瘤組織切片內(nèi)可見,大部分瘤組織內(nèi)的血管為經(jīng)典的機(jī)體血管,由CD34染色陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞和PAS染成櫻桃紅色的基底膜構(gòu)成。部分切片內(nèi)可見由CD34染色陰性的細(xì)胞和基底膜組成的管腔樣結(jié)構(gòu),其內(nèi)有紅細(xì)胞,此即為擬態(tài)血管。按照方法三標(biāo)準(zhǔn),由3名病理診斷醫(yī)師獨(dú)立閱片,共發(fā)現(xiàn)8例患者存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象,其中7例為膠

19、質(zhì)母細(xì)胞瘤,1例為間變型星形細(xì)胞瘤患者。
　　 二、VM和臨床資料間的關(guān)系
　　 VM在星形細(xì)胞瘤中的發(fā)生率分別為,彌漫型星形細(xì)胞瘤0(0/30),間變型星形細(xì)胞瘤5％(1/20),膠質(zhì)母細(xì)胞瘤27％(7/30)。7例有VM膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位生存期是8.6個(gè)月,而沒有VM的23例患者的中位生存期是13.4個(gè)月;19例沒有VM間變型星形細(xì)胞瘤患者的中位生存期是32.7個(gè)月,1例有VM間變型星形細(xì)胞瘤患者在手術(shù)后14個(gè)月

20、死亡。
　　 三、細(xì)胞三維培養(yǎng)的形態(tài)觀察
　　 當(dāng)在Matrigel上培養(yǎng)48 h后,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀、網(wǎng)絡(luò)狀等典型的血管腔樣結(jié)構(gòu),高度惡性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251也能夠形成相似的血管腔樣結(jié)構(gòu);而正常的大鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞和低度惡性的星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系SHG44則在相同培養(yǎng)條件下不能形成血管腔樣結(jié)構(gòu)。
　　 四、恩度對(duì)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的抑制作用
　　 隨著藥物濃度增加,恩度對(duì)U251細(xì)胞和SHG44

21、細(xì)胞增殖抑制作用有所提高;同時(shí),隨著加藥處理時(shí)間延長(zhǎng),抑制率也存在升高的趨勢(shì)。藥物濃度為250、500、1000μl/ml作用時(shí)間為24 h時(shí),對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制率分別為15.42％、23.75％和32.32％,對(duì)SHG44細(xì)胞的增殖抑制率為14.63％、18.10％、28.19％。
　　 五、恩度對(duì)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲的抑制作用
　　 當(dāng)作用24 h時(shí),隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯減少,細(xì)胞侵襲能力下降。在

22、藥物濃度為250、500、1000μg/ml時(shí),對(duì)U251細(xì)胞的侵襲抑制率分別為57.51％、83.74％和88.53％,對(duì)SHG44細(xì)胞的侵襲抑制率為43.26％、70.84％和80.09％,同時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)變圓、狀態(tài)變差情況。
　　 六、恩度對(duì)U251體外形成VM的作用
　　 經(jīng)恩度作用48h后,隨著藥物濃度的增加,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel上形成的血管腔樣結(jié)構(gòu)逐漸減少,當(dāng)濃度為1000μg/ml時(shí),不能再形成管

23、腔結(jié)構(gòu)。而U251細(xì)胞經(jīng)恩度加藥處理后,網(wǎng)狀連接稍有破壞,但管狀結(jié)構(gòu)依然存在,各濃度沒有顯著差異。
　　 七、細(xì)胞VE-Cadherin和EphA2 mRNA及蛋白的表達(dá)
　　 Real time RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞VE-Cadherin和EphA2的mRNA表達(dá)量和Westernblot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)量結(jié)果相似。VE-Cadherin在U251和HUVECs中高表達(dá),在SHG44和正常膠質(zhì)細(xì)胞中幾乎不表達(dá);EphA

24、2在星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251和SHG44中高表達(dá),在HUVECs和正常膠質(zhì)細(xì)胞中低表達(dá)。
　　 八、恩度對(duì)細(xì)胞VE-Cadherin和EphA2表達(dá)的抑制作用
　　 恩度作用24后,隨著藥物濃度的增加,星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251和SHG44中EphA2的表達(dá)量逐漸降低;HUVECs中VE-Cadherin的表達(dá)量也隨著藥物濃度的增加而降低,但恩度對(duì)U251細(xì)胞VE-Cadherin的表達(dá)沒有明顯抑制作用。
　　 結(jié)

25、論：
　　 1、人星形細(xì)胞瘤組織中存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象。
　　 2、人腫瘤組織和體外培養(yǎng)均提示,血管生成擬態(tài)與腫瘤分化有關(guān),分化越低,越可能存在VM。
　　 3、血管生成擬態(tài)的出現(xiàn)預(yù)示星形細(xì)胞瘤預(yù)后不良。
　　 4、恩度在體外有效抑制星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251、SHG44的增殖和侵襲,可能是通過(guò)下調(diào)細(xì)胞EphA2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　 5、恩度在體外顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞形成的血管樣結(jié)構(gòu),但不能有效抑制星形