透明質(zhì)酸和羥丙基甲基纖維素對滴眼液常用防腐劑誘導(dǎo)人結(jié)膜上皮細(xì)胞DNA損傷保護(hù)及修復(fù)機理研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了闡述。
　　第一部分常用防腐劑硫柳汞以及過硼酸鈉誘導(dǎo)人結(jié)膜上皮細(xì)胞DNA損傷的研究。
　　目的:
　　硫柳汞(Thimerosal，Thi)是目前臨床使用的滴眼液中常添加的防腐劑，過硼酸鈉是主要用于人工淚液中的新型氧化型低毒防腐劑。本研究擬探討硫柳汞和過硼酸鈉對體外培養(yǎng)的人結(jié)膜上皮細(xì)胞DNA損傷、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、細(xì)胞存活率的影響。
　　方法:

2、
　　將細(xì)胞分為二組，用濃度為0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％及0.001％的硫柳汞和過硼酸鈉分別作用于體外培養(yǎng)的人結(jié)膜上皮細(xì)胞30分鐘。應(yīng)用甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT法）檢測細(xì)胞存活率;堿性彗星實驗用于檢測以DNA單鏈斷裂(DNA single-strand breaks，SSBs)為主的DNA損傷;用免疫熒光法檢測細(xì)胞核內(nèi)磷酸化的H2AX(γH2AX)焦點形成，以評估以DNA雙鏈斷裂(DNAd

3、ouble-strand breaks，DSBs)為主的DNA損傷情況及嚴(yán)重程度;以乙酰乙酸雙氯熒光素(DCFH-DA)為探針，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　　結(jié)果：
　　MTT結(jié)果表明，0.001％硫柳汞可導(dǎo)致顯著的細(xì)胞存活率下降(P＜0.001)。而堿性彗星實驗則顯示，0.00005％～0.001％的硫柳汞均可導(dǎo)致顯著的細(xì)胞核SSBs(P＜0.001)。免疫熒光法也發(fā)現(xiàn)不同濃度的硫柳汞處理后結(jié)膜上皮細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)

4、含有γH2AX焦點的細(xì)胞比例及焦點數(shù)均較對照組顯著增加(P＜0.05)，表明硫柳汞可導(dǎo)致細(xì)胞核DSBs形成。隨濃度的增加，硫柳汞所致的DNA損傷加重。流式細(xì)胞儀檢測表明，不同濃度硫柳汞處理后的人結(jié)膜上皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平較對照組增高，差異有顯著性(P＜0.001)。與DNA損傷不同的是，0.001％濃度組產(chǎn)生的ROS水平較0.0005％組低，這可能和細(xì)胞生存率的下降有關(guān)。而過硼酸鈉作用于人結(jié)膜上皮細(xì)胞30分鐘后細(xì)胞生存率無變化，0.001

5、％濃度組可引起明顯DSBs和SSBs，且可引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高，過硼酸鈉在各個濃度組引起的ROS水平升高均小于硫柳汞。
　　結(jié)論：
　　硫柳汞可導(dǎo)致人結(jié)膜上皮細(xì)胞細(xì)胞核DNA損傷并影響細(xì)胞活性。硫柳汞所致的細(xì)胞內(nèi)ROS增加可能與DNA損傷相關(guān)。過硼酸鈉不影響細(xì)胞生存率，高濃度可引起DNA損傷以及細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高，過硼酸鈉對結(jié)膜上皮細(xì)胞的DNA毒性小于硫柳汞。
　　第二部分透明質(zhì)酸和羥丙基甲基纖維素對硫柳汞所致人

6、結(jié)膜上皮細(xì)胞DNA損傷抗氧化保護(hù)作用的研究。
　　目的：
　　透明質(zhì)酸(hyaluronan，HA)以及羥丙基甲基纖維素(hydroxypropylmethylcellulose，HPMC)是廣泛應(yīng)用于眼科臨床治療干眼癥患者所用的人工淚液替代物。本研究擬探討HA以及HPMC對硫柳汞引起的對體外培養(yǎng)的人結(jié)膜上皮細(xì)胞DNA損傷、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、細(xì)胞存活率下降的保護(hù)作用。
　

7、　方法：
　　將細(xì)胞分為3組，一組采用濃度分別為0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％及0.001％的硫柳汞單獨處理30min，另兩組分別用0.3％ HA或者0.3％ HPMC預(yù)處理30分鐘再給予相同的硫柳汞處理。用MTT法檢測細(xì)胞存活率，堿性彗星實驗和免疫熒光法檢測細(xì)胞核內(nèi)磷酸化的H2AX(γH2AX)焦點檢測DNA損傷，以乙酰乙酸雙氯熒光素(DCFH-DA)為探針，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平

8、。
　　結(jié)果：
　　MTT結(jié)果表明，使用0.001％硫柳汞處理30分鐘后，細(xì)胞生存率出現(xiàn)明顯下降。各個濃度引起的DNA單鏈或雙鏈斷裂以及細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高基本呈劑量效應(yīng)，然而，細(xì)胞用0.3％ HPMC或0.3％ HA預(yù)處理30分鐘后，與單獨硫柳汞處理組比較，可以顯著提高細(xì)胞生存率，降低DNA損傷以及細(xì)胞內(nèi)ROS水平，且HA的抗氧化細(xì)胞保護(hù)作用要優(yōu)于HPMC。
　　結(jié)論：
　　硫柳汞可引起角膜上皮細(xì)胞DNA損傷，

9、氧化應(yīng)激可能為其機制。HA以及HPMC具有抗氧化作用，可抑制硫柳汞引起的DNA損傷，從而可在淚液替代成分的作用之外發(fā)揮眼表保護(hù)作用，且HA的保護(hù)作用要優(yōu)于HPMC。
　　第三部分硫柳汞急性暴露所致人結(jié)膜上皮細(xì)胞DNA損傷修復(fù)機理的研究。
　　目的：
　　在前期的實驗中，已證實硫柳汞短期暴露可引起眼表上皮細(xì)胞DNA損傷以及ROS產(chǎn)生增加。本研究擬檢測給予細(xì)胞24h修復(fù)后的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分布、線粒體膜電位以及相關(guān)靶蛋白

10、的表達(dá)，探討硫柳汞急性暴露后細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機制。
　　方法：
　　將細(xì)胞先用0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％及0.001％硫柳汞處理30min之后洗去藥液，換上新鮮培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)24h后，檢測細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞生存率、用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，細(xì)胞凋亡，線粒體膜電位，用western blot檢測凋亡蛋白PARP、Caspase3以及自噬蛋白LC-3的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：

11、r>　　用硫柳汞處理30min后，并未引起明顯的細(xì)胞凋亡，而在24h修復(fù)后，0.0005％-0.001％組卻出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡(p＜0.001)，流式細(xì)胞儀檢測顯示處理30min后0.0005％-0.001％組線粒體膜電位出現(xiàn)明顯下降(p＜0.001)，24h后細(xì)胞周期出現(xiàn)了G2M期阻滯，Western blot結(jié)果顯示凋亡標(biāo)志蛋白PARP以及caspase3出現(xiàn)活化片段，自噬標(biāo)志蛋白LC-3也出現(xiàn)了活化片段。
　　結(jié)論：