透明質酸對脂肪干細胞增殖和分化的影響.pdf

1、成體干細胞(adult stem cells，ASCs)分布廣泛、增殖力強且具有多向分化潛能，一直是組織工程“種子細胞”研究的熱點。其中，以骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)研究最多，應用最廣。但其純化率較低且數(shù)量有限，難以滿足臨床應用的需求；取材時對機體造成的創(chuàng)傷較大；而且骨髓中干細胞的比例、增殖能力都會隨年齡的增長和骨質疏松的發(fā)生逐漸下降，因此探索一種新的組織工程“種子細胞”十分必要。

2、脂肪組織再生能力強，體內儲量豐富，取材創(chuàng)傷小，細胞可大量獲取，有望成為最重要的種子細胞來源庫。自2001年Zuk等在脂肪組織中發(fā)現(xiàn)具有多向分化潛能的、成纖維細胞樣的干細胞以來，相繼在包括人類在內的多個物種的研究結果表明其具有多向分化能力。脂肪干細胞(adipose tissue-derived stem cells，ADSCs)有望成為組織工程的“種子細胞”之一。 透明質酸(hyaluronic acid，HA)是近年來發(fā)現(xiàn)的大

3、分子酸性粘多糖，廣泛存在于人體內，譬如它是顳下頜關節(jié)滑液和關節(jié)軟骨基質的重要成分，以鈉鹽的形式存在，即透明質酸鈉(sodium hyaluronate，SH)，起潤滑關節(jié)的作用。透明質酸可減小組織間的摩擦，緩沖咀嚼對關節(jié)軟骨的壓力，營養(yǎng)軟骨，保護受損的軟骨細胞，同時具有鎮(zhèn)痛止血的效果。顳下頜關節(jié)紊亂病患者滑液中透明質酸的含量明顯減少，軟骨細胞及滑膜細胞受損程度明顯增加。另外有研究表明透明質酸可以增強體外培養(yǎng)的關節(jié)軟骨細胞及滑膜細胞的分泌

4、功能并可延長其壽命。 眾所周知，干細胞在經(jīng)體外長期培養(yǎng)后，其增殖活性和分化能力都會有所降低。雖然ADSCs在體外傳代能力較BMSCs強，但隨著傳代的增加，其增殖活性和分化能力也會有所降低。迄今為止，尚無一種可靠的方法可以促進ADSCs增殖和分化。本實驗以小型豬ADSCs為實驗細胞，透明質酸為作用物質，檢測透明質酸對體外培養(yǎng)的小型豬ADSCs增殖和分化潛能的積極影響，并進一步探索一種較為理想的延長體外培養(yǎng)干細胞壽命及增強其分化能力

5、的手段。 第一部分 透明質酸對脂肪干細胞增殖活性的影響 目的: 1.研究透明質酸對體外培養(yǎng)的小型豬ADSCs增殖活性的影響，為組織工程種子細胞壽命的延長奠定理論基礎和實驗依據(jù)。 2.探索增強體外培養(yǎng)小型豬ADSCs增殖活性的透明質酸的最適宜濃度。 方法： 實驗分組：A．對照組(基礎培養(yǎng)基)；B．低濃度組(基礎培養(yǎng)基+HA0.01mg/ml)：C．中濃度組(基礎培養(yǎng)基+HA 0.1mg/ml

6、)；D．高濃度組(基礎培養(yǎng)基+HA 1.0mg/ml)。 實驗步驟：3-5代小型豬ADSCs體外培養(yǎng)1周，消化傳代接種至24孔板上，培養(yǎng)1天，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。分別加入基礎培養(yǎng)基、含不同濃度透明質酸的培養(yǎng)基，培養(yǎng)3、7、14、21天觀察細胞形態(tài)；傳代檢測傳代后細胞的生長情況；同時MTT法檢測其生長增殖情況并繪制生長曲線。本實驗數(shù)據(jù)值以-X±S表示，多組間比較采用重復測量資料的方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢

7、驗進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計軟件采用SPSS 13.0 for Windows，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。 結果： 1.透明質酸作用于ADSCs后，細胞形態(tài)、生長曲線等發(fā)生改變，增殖活性受到影響。 2.各實驗組均可在第3天觀察到細胞形態(tài)發(fā)生變化。高濃度組細胞成簇狀生長，不能完全伸長，細胞呈多突起星形。低、中濃度組細胞形態(tài)較好，呈典型的長梭形(成纖維細胞樣)。14天及21天時細胞形態(tài)及數(shù)量發(fā)生明顯差別，高、低濃度

8、組培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)一些雜質細胞及脂肪細胞，胞質內可見脂滴，部分細胞形態(tài)呈多角形或圓形，細胞生長緩慢；中濃度組及對照組細胞形態(tài)仍較好，生長良好。 3.細胞傳代后貼壁時間組間有差異；中濃度組細胞貼壁最早，貼壁時間約為4小時。高、低濃度組的貼壁時間均長于對照組。 4.MTT法繪制生長曲線結果顯示各組ADSCs在傳代后均經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期；總體來說，中濃度組細胞生長最快，高濃度組細胞生長最慢，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學

9、意義(P<0.05)，但低濃度組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結論： 不同濃度的透明質酸對ADSCs的增殖作用不同，當培養(yǎng)液中透明質酸的濃度為0.1mg/ml時，對ADSCs的生長增殖具有促進作用；透明質酸濃度為1mg/ml時，降低ADSCs的增殖活性；濃度為0.01mg/ml時，與對照組比較，無明顯差異。 第二部分 透明質酸對脂肪干細胞分化能力的影響 目的： 1.研究透明質酸

10、對體外培養(yǎng)的小型豬ADSCs分化能力的影響，為組織工程種子細胞分化能力的提高奠定理論基礎和實驗依據(jù)。 2.探索增強體外培養(yǎng)小型豬ADSCs分化能力的透明質酸的最適宜濃度。 方法： 實驗分組：A．對照組(傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基)；B．低濃度組(傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基+HA 0.01mg/ml)；C．中濃度組(傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基+HA 0.1mg/ml)；D．高濃度組(傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基+HA 1.0mg/ml)。 實驗步驟：3-5

11、代小型豬ADSCs體外培養(yǎng)1周，消化傳代接種至24孔板，培養(yǎng)1周，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。分組加入傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基，含高、中、低濃度透明質酸的誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)3、7、14、21天觀察細胞形態(tài)；培養(yǎng)14天后油紅O、蘇丹黑B染色鑒定成脂誘導效果；Von kossa、茜素紅染色及ALP活性檢測鑒定成骨誘導效果。堿性磷酸酶定量檢測數(shù)據(jù)值以-X±S表示，多組間比較采用重復測量資料的方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計

12、軟件采用SPSS 13.0 for Windows，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。 結果： 1.透明質酸作用于ADSCs后，其仍保持向脂肪細胞和成骨細胞分化的能力。 2.加入各組成脂誘導培養(yǎng)基后，所有組均可在第3天觀察到細胞形態(tài)變?yōu)槎趟笮?、橢圓形，于誘導的第7天開始細胞胞質內有脂滴形成，以后逐漸增多。油紅。及蘇丹黑B染色結果顯示高濃度組脂滴形成效率明顯高于低、中濃度組，低、中濃度組又高于對照組。 3.

13、加入各組成骨誘導培養(yǎng)基后，所有組均可在第3天觀察到細胞形態(tài)變?yōu)槎嘟切危谡T導的第5天開始細胞呈集簇狀生長。Von kossa、茜素紅染色及ALP染色結果顯示高濃度組礦化結節(jié)形成效率明顯高于對照組，低、中濃度組略高于對照組，ALP活性檢測結果顯示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論： 透明質酸作用于成脂誘導、成骨誘導的ADSCs后，細胞形態(tài)發(fā)生改變，分化效率受到影響。實驗中三個濃度的透明質酸對體外培養(yǎng)的ADSCs的成脂