透明質(zhì)酸對滴眼液常用促滲劑誘導角膜上皮細胞DNA損傷保護作用的研究.pdf

1、第一部分透明質(zhì)酸對苯扎氯銨誘導角膜上皮細胞DNA損傷保護作用的研究
　　 目的：
　　 苯扎氯銨(benzalkonium chloride,BAC)是目前臨床使用的滴眼液中常添加的防腐劑。本研究擬探討苯扎氯銨對體外培養(yǎng)的人角膜上皮細胞(human cornealepithelial cells,HCEs)DNA損傷、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、細胞存活率及細胞凋亡的影響,以及透明質(zhì)

2、酸對苯扎氯銨所致的人角膜上皮細胞DNA毒性效應的保護作用。
　　 方法：
　　 用濃度為0.00005％、0.0001％、0.0005％及0.001％的苯扎氯銨分別作用于體外培養(yǎng)的人角膜上皮細胞30分鐘,另一組細胞采用0.2％透明質(zhì)酸與不同濃度苯扎氯銨聯(lián)合作用30分鐘。應用甲基偶氮唑藍比色法(MTT法)檢測細胞存活率；用Annexin V-FITC／PI試劑盒檢測細胞凋亡；堿性彗星實驗用于檢測以DNA單鏈斷裂(DNA s

3、ingle-strand breaks,SSBs)為主的DNA損傷；用免疫熒光法檢測細胞核內(nèi)磷酸化的H2AX(γH2AX)焦點形成,以評估以DNA雙鏈斷裂(DNAdouble-strand breaks,DSBs)為主的DNA損傷情況及嚴重程度；以乙酰乙酸雙氯熒光素(DCFH-DA)為探針,應用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS水平。
　　 結(jié)果：
　　 MTT結(jié)果表明,0.001％苯扎氯銨可導致顯著的細胞存活率下降(P<0.0

4、01),凋亡實驗也顯示,僅0.001％苯扎氯銨可致顯著的HCEs細胞凋亡(P<0.001)。而堿性彗星實驗則顯示,四個濃度的苯扎氯銨均可導致顯著的HCEs細胞核SSBs(P<0.001)。免疫熒光法也發(fā)現(xiàn)不同濃度的苯扎氯銨處理后HCEs細胞核內(nèi)含有γH2AX焦點的細胞比例及焦點數(shù)均較對照組顯著增加(P<0.05),表明苯扎氯銨可導致HCEs細胞核DSBs形成。隨濃度的增加,苯扎氯銨所致的DNA損傷加重。流式細胞儀檢測表明,不同濃度苯扎氯

5、銨處理后的HCEs細胞內(nèi)ROS水平較對照組增高,差異有顯著性(P<0.001)。而混合有透明質(zhì)酸的苯扎氯銨作用于HCEs30分鐘后則顯著抑制了苯扎氯銨所致的細胞存活率下降、細胞凋亡、DNA損傷及細胞內(nèi)ROS水平增高。
　　 結(jié)論：
　　 苯扎氯銨可導致HCEs細胞核DNA損傷并影響細胞活性。苯扎氯銨所致的細胞內(nèi)ROS增加可能與DNA損傷相關(guān)。透明質(zhì)酸可抑制苯扎氯銨所致的角膜上皮細胞DNA損傷、ROS增加及細胞凋亡。

6、>　　 第二部分透明質(zhì)酸對乙二胺四乙酸誘導角膜上皮細胞DNA損傷保護作用的研究
　　 目的：
　　 乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)是目前臨床使用的滴眼液中常添加的螯合劑。本研究擬探討EDTA對體外培養(yǎng)的人角膜上皮細胞(humancorneal epithelial cells,HCEs)DNA損傷、活性氧(ROS)、細胞存活率、細胞凋亡的影響,以及透明質(zhì)酸對ED

7、TA所致的人角膜上皮細胞DNA毒性效應的保護作用。
　　 方法：
　　 用濃度為0.00001％、0.0001％、0.001％及0.01％的EDTA分別作用于體外培養(yǎng)的人角膜上皮細胞30分鐘,另一組細胞采用0.2％透明質(zhì)酸預處理30分鐘后,再用不同濃度EDTA作用30分鐘。應用甲基偶氮唑藍比色法(MTT法)檢測細胞存活率；用Annexin V-FITC／PI試劑盒檢測細胞凋亡；堿性彗星實驗用于檢測以DNA單鏈斷裂(DNA

8、 single-strand breaks,SSBs)為主的DNA損傷；用免疫熒光法檢測細胞核內(nèi)磷酸和的H2AX(γH2AX)焦點形成,以評估以DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks,DSBs)為主的DNA損傷情況及嚴重程度；以乙酰乙酸雙氯熒光素(DCFH-DA)為探針,應用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS水平。
　　 結(jié)果：
　　 EDTA未降低角膜上皮細胞存活率或?qū)е录毎蛲?P>0.05)。但堿

9、性彗星實驗顯示,低濃度的EDTA即可導致顯著的HCEs細胞核SSBs(P<0.01)。γH2AX免疫熒光法也發(fā)現(xiàn)不同濃度的EDTA處理后的HCEs細胞核內(nèi)含有γH2AX焦點的細胞比例及焦點數(shù)均較對照組顯著增加(P<0.05)。流式細胞儀檢測表明,不同濃度EDTA處理后的HCEs細胞內(nèi)ROS水平較對照組增高,差異有顯著性(P<0.01)。而用透明質(zhì)酸預處理30分鐘后的HCEs則未見EDTA所致的DNA損傷及細胞內(nèi)ROS水平增高。