扶正清熱利濕法防治再發(fā)性尿路感染的臨床與實(shí)驗(yàn)研究及病原學(xué)分析.pdf

1、尿路感染(urinary tract infection，UTI)是最常見的感染性疾病之一，極易復(fù)發(fā)和重新感染，對于在半年內(nèi)發(fā)作2次、1年內(nèi)發(fā)作3次以上的尿路感染，屬再發(fā)性尿路感染(recurrentant urine tract infections，RUTIs)，其反復(fù)發(fā)作和細(xì)菌耐藥是臨床治療的關(guān)鍵和難點(diǎn)。尋找安全有效的抗生素替代治療方案有重要現(xiàn)實(shí)意義，這正是發(fā)揮中醫(yī)辨證論治優(yōu)勢所在。嚴(yán)格設(shè)計(jì)的臨床隨機(jī)對照試驗(yàn)和深入病原學(xué)機(jī)理研究具

2、有十分重要的意義。本研究在前期臨床辨證治療的基礎(chǔ)上，針對再發(fā)性尿路感染，開展扶正清熱利濕法治療尿路感染的臨床與實(shí)驗(yàn)研究，同時對最常見的尿路感染病原菌--尿路致病性大腸桿菌(uropathogenicEscherichia coli，UPEC)的基因型、致病性及耐藥性進(jìn)行了深入研究。本研究分為三部分：(1)扶正清熱利濕法辨證治療再發(fā)性尿路感染的臨床研究。(2)尿路感染病原學(xué)分析--UPEC基因型、毒力基因及耐藥譜研究。(3)扶正清熱利濕法

3、治療UPEC尿路感染動物模型的實(shí)驗(yàn)研究。本文從以下幾部分進(jìn)行了闡述。
　　第一部分：扶正清熱利濕法治療再發(fā)性尿路感染的臨床研究。
　　目的：通過平行、隨機(jī)、對照、盲法的前瞻性臨床研究，觀察扶正清熱利濕法辨證治療對于再發(fā)性尿路感染癥狀緩解率、細(xì)菌清除率、復(fù)發(fā)及再發(fā)率的影響，客觀評價扶正清熱利濕法對再發(fā)性尿路感染的防治療效。
　　方法：采用了平行、隨機(jī)、對照的前瞻性臨床研究設(shè)計(jì)，根據(jù)中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)將符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的再發(fā)性尿路感

4、染患者分為陰虛濕熱證和陽虛挾濕證兩層，每層采用區(qū)組隨機(jī)法分為治療組和對照組，共納入觀察病例90例，其中陰虛證中藥組40例，對照組20例，陽虛證中藥組20例，對照組10例。陰虛中藥組采用滋陰通淋法(通淋1號)，陽虛中藥組服用溫陽通淋法(通淋2號)治療，療程4周。對照組根據(jù)藥敏選用抗生素同時服用安慰劑，療程1周。共隨訪6個月。觀察扶正清熱利濕法辨證治療對于再發(fā)性尿路感染癥狀緩解率、尿檢WBC轉(zhuǎn)陰率、細(xì)菌清除率、復(fù)發(fā)及再發(fā)率的影響。
　

5、　結(jié)果：1、對全部入組病例的年齡、發(fā)作次數(shù)、致病菌種分布情況分析顯示，入組患者均為女性，年齡中位數(shù)為56.5歲。主要病原菌為革蘭氏陰性桿菌。其中最多見為大腸埃希氏菌，占63.8％，該菌種在陰虛證組所占百分比為63％，和陽虛證組(64％)相比無明顯差異。分離到大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯、腸球菌屬的患者發(fā)作次數(shù)較高在(>5次/6月)。2、中藥組、對照組證候療效結(jié)果顯示，中藥組痊愈、顯效百分比高于對照組，總有效率與對照組相當(dāng)。其中，陰虛證中藥組

6、尿急、尿頻、尿道灼痛、尿黃赤混濁、少腹脹癌癥狀均有極顯著改善(P<0.01)，尿不盡癥狀顯著改善(P<0.05)，西藥組治療前后癥狀無顯著性差異。兩組比較，中藥組對尿頻癥狀的改善顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)，其他癥狀無顯著差異。證候?qū)W療效評價結(jié)果顯示，陰虛證中藥組有效率與對照組相當(dāng)(P>0.05)，中藥組癥狀痊愈率高于對照組。陽虛證中藥組小便不暢、小腹墜脹、顏面浮腫、肢體浮腫癥狀改善顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)，遇勞加劇、大便溏薄癥

7、狀有極顯著差異(P<0.01)。證候?qū)W療效評價結(jié)果顯示，陽虛證中藥組有效率、痊愈率均高于西藥組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3、兩組治療1周后尿檢WBC的轉(zhuǎn)陰率比較結(jié)果顯示：不管在陰虛證組、陽虛證組還是兩證合并后統(tǒng)計(jì)，中藥組的尿WBC轉(zhuǎn)陰率均顯著高于對照組(P<0.001)。4、不管在陰虛證組、陽虛證組還是兩證合并后統(tǒng)計(jì)，在治療第14d，中藥組細(xì)菌清除情況優(yōu)于對照組，而隨監(jiān)測時間延長，兩組差異越來越小，在療程結(jié)束時，兩組細(xì)菌清除率相當(dāng)。比較兩組大腸

8、埃希氏菌(Ecoli)感染RUTIs患者的細(xì)菌清除情況，在治療第14d，中藥組細(xì)菌清除情況顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)，而隨監(jiān)測時間延長，兩組差異越來越小，在療程結(jié)束時，兩組細(xì)菌清除率相當(dāng)。對于產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(EBSL)大腸埃希氏菌、耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRSCON)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)，中藥均可有效清除(75％)，對照組未能清除。5、隨訪6個月后統(tǒng)計(jì)兩組復(fù)發(fā)率，中藥組復(fù)發(fā)率均低于對照組，陰虛證組有顯著

9、性差異(P<0.001)。
　　結(jié)論：1、再發(fā)性尿路感染主要致病菌為大腸埃希氏菌，該菌也是引起反復(fù)發(fā)作的主要致病菌。2、扶正清熱利濕法辨證治療對于部分陽虛證候的改善顯著優(yōu)于西藥組，對于陰虛證候的療效不劣于西藥組，特別對于濕熱下注證候療效顯著。中藥總體證候療效不劣于西藥組。3、扶正清熱利濕法辨證治療有助于促進(jìn)炎癥恢復(fù)，減少組織損傷。4、扶正清熱利濕法辨證治療對于致病菌的清除效率高于西藥組，總體清除能力不劣于西藥組。同時能夠有效清除產(chǎn)

10、耐藥酶菌株。5、扶正清熱利濕法辨證治療防止尿路感染再發(fā)療效優(yōu)于西藥組。
　　第二部分尿路感染病原學(xué)分析--UPEC分離株的基因型、毒力基因及耐藥譜研究。
　　目的：針對再發(fā)性尿路感染最常見致病菌UPEC，通過對其基因型及遺傳多態(tài)性、致病性(毒力基因分布)、耐藥性以及三者之間相關(guān)性的研究，探討UPEC致病和耐藥的病原學(xué)特征及其可能的生物學(xué)機(jī)制。
　　方法：采用重復(fù)序列PCR(rep-PCR)指紋分析技術(shù)，通過對模板制備、

11、擴(kuò)增條件和電泳條件等的優(yōu)化，建立UPEC的Rep-PCR分型方法，對我院分離的205株UPEC菌株進(jìn)行Rep-PCR分型，了解是否存在親緣相近的基因型組和基因多態(tài)性。選取在UPEC中有廣泛分布的24個毒力基因，設(shè)計(jì)合成引物，在分離株中篩選毒力基因，了解各分離株的毒力基因分布情況。采用藥敏紙片法測定UPEC臨床分離株對常見的17種抗生素的耐藥譜。綜合細(xì)菌的基因型、毒力基因分布和耐藥譜，分析三者之間的關(guān)系，探討UPEC致病和耐藥的生物學(xué)機(jī)制

12、。
　　結(jié)果：1、通過條件的摸索和優(yōu)化，建立了UPEC分離株的Rep-PCR分析方法。2、205株UPEC分離株經(jīng)Rep-PCR分析，共分出了158個分支，這些型聚類為A到H共8個基因組群。3、毒力基因篩選結(jié)果顯示，已知的24個毒力基因中我們檢測到15個，最常見的為Fimh、traT、AerJ、papGⅢ、PAI、fyuA、PapG，且各毒力基因在分離株中的分布存在顯著差別。4、耐藥譜分析結(jié)果顯示，耐藥率(未計(jì)入中度耐藥)最高的是

13、派拉西林，耐藥率為78.54％，其次是慶大霉素、左氧氟沙星、頭孢唑啉，分別為66.34％、65.37％和50.24％。不同科室的UPEC分布和耐藥性存在較大差異。5、各基因型組主要毒力基因分布情況相似，E、F組攜帶毒力基因較少，但各基因型組的耐藥性無明顯差異。6、毒力基因數(shù)量與EBSL、耐藥率呈顯著正相關(guān)，其中traT與耐藥呈極顯著正相關(guān)，PAI與敏感性呈顯著負(fù)相關(guān)，某些毒力基因之間也存在一定相關(guān)性。
　　結(jié)論：1、UPEC分離株

14、基因型別眾多，存在遺傳多態(tài)性，其主要基因型的菌株在各科室均有流行。2、UPEC對多種抗生素均耐藥，表現(xiàn)為多重耐藥和泛耐藥。3、UPEC的致病相關(guān)毒力基因與耐藥性存在顯著正相關(guān)，攜帶毒力基因越多，耐藥性越強(qiáng)。4、UPEC基因型與耐藥性之間未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性，提示其耐藥性可能通過質(zhì)粒水平向快速傳遞獲得為主。
　　第三部分：扶正清熱利濕法治療UPEC尿路感染Balb/c小鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究。
　　目的：根據(jù)毒力基因分布和耐藥性分析，選

15、擇致病性強(qiáng)、泛耐藥、產(chǎn)EBSL的UPEC菌株，建立Balb/c小鼠尿路感染模型。采用扶正清熱利濕方和亞胺培南(IPM)分別對小鼠模型進(jìn)行干預(yù)，評價中藥對多重耐藥UPEC尿路感染小鼠模型的治療作用以及對UPEC耐藥性的影響。采用體外抑菌試驗(yàn)，分析中藥的抑菌/殺菌作用。
　　方法：根據(jù)UPEC毒力基因和耐藥性分布，選取UPEC分離株，分別以高、中、低劑量量(1×109，1×108和1×107 cfu)尿路感染Balb/c小鼠，感染后觀

16、察小鼠精神狀態(tài)和死亡情況，對尿液中分離細(xì)菌計(jì)數(shù)，分析尿液中排菌情況；將造模成功的小鼠模型隨機(jī)分為中藥高、低劑量組、抗生素組和模型對照組，分別給予中藥和IPM治療，正常小鼠作空白對照組，觀察治療后各組小鼠死亡情況和存活小鼠精神狀態(tài)，分析尿液、脾、腎、膀胱中細(xì)菌數(shù)變化，分析各組小鼠臟器指數(shù)，綜合分析比較各組療效。對治療后分離的細(xì)菌的耐藥性進(jìn)行分析，比較中藥與抗生素對細(xì)菌耐藥性的影響。通過體外抑菌試驗(yàn)，分析中藥及抗生素原藥及含藥血清對UPEC

17、201菌株的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。
　　結(jié)果：1、選取了UPEC201菌株(攜帶主要毒力基因、僅對亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦敏感)作為造模用菌株。選取高劑量(1×109)為造模劑量，建立了UPEC201菌株的UTI小鼠模型。該劑量下小鼠感染后死亡率為33.4％，感染后第21天仍能檢測到細(xì)菌。2、與模型對照組相比，治療后各治療組小鼠死亡率降低，高劑量組、低劑量組和抗生素組的治愈率分別為80％、40％和80％。各治療

18、組小鼠的精神狀態(tài)明顯好于模型組，在觀察結(jié)束時精神狀態(tài)可恢復(fù)到正常小鼠狀態(tài)。3、細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，各治療組療后尿菌計(jì)數(shù)顯著下降，在治療后第7天，高劑量組和抗生素組尿液中細(xì)菌完全清除。而臟器中的細(xì)菌并不能被清除。第14d，中藥高劑量組膀胱、脾臟細(xì)菌計(jì)數(shù)均低于模型組和抗生素組，尿液、腎臟的細(xì)菌計(jì)數(shù)與抗生素相當(dāng)。4、各治療組小鼠的臟器指數(shù)與模型組相比降低，其中高劑量組與抗生素組的臟器指數(shù)相當(dāng)。5、中藥治療后，細(xì)菌的耐藥性發(fā)生了變化，對多種抗生素

19、的敏感性增加，質(zhì)粒分析顯示，經(jīng)過治療后小鼠的細(xì)菌的部分質(zhì)粒得到清除。6、中藥的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，中藥對UPEC201菌株的最低抑菌濃度為250mg/ml，未發(fā)現(xiàn)殺菌作用。經(jīng)灌胃小鼠制備的含藥血清對細(xì)菌沒有抑菌作用，但體外制備的含有中藥的血清對抑菌有抑制作用，測得最低抑菌濃度降低為125mg/ml。
　　結(jié)論：1、扶正清熱利濕方對高致病、多重耐藥UPEC尿路感染小鼠模型具有治療作用，與亞胺培南的療效相當(dāng)；2、中藥和亞胺培南均不能

20、徹底將UPEC從模型小鼠體內(nèi)完全清除，這可能是UPEC引起再發(fā)的原因。3、中藥高劑量組膀胱、脾臟細(xì)菌計(jì)數(shù)均低于模型組和抗生素組，尿液、腎臟的細(xì)菌計(jì)數(shù)與抗生素相當(dāng)，提示中藥可能對于抑制UPEC在臟器寄生的作用優(yōu)于抗生素。4、中藥治療后小鼠模型臟器指數(shù)低于模型對照組，與抗生素組相當(dāng)，提示在改善感染后臟器炎癥損傷方面中藥與抗生素療效相當(dāng)。5、扶正清熱利濕中藥能夠通過消除致病菌的某些質(zhì)粒一定程度降低細(xì)菌的耐藥性，使其對多種抗生素的敏感性增加。6

21、、扶正清熱利濕中藥體外對UPEC具有抑菌作用。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1、首次采用嚴(yán)格設(shè)計(jì)的平行、隨機(jī)、對照、盲法的前瞻性多中心臨床研究，系統(tǒng)觀察了扶正清熱利濕法辨證分型對改善再發(fā)性尿路感染患者中醫(yī)證候、炎癥消除、減少復(fù)發(fā)的作用，并進(jìn)行了療效評價。
　　2、采用重復(fù)序列PCR(rep-PCR)指紋分析技術(shù)，對引起尿路感染最常見的致病菌--UPEC進(jìn)行了基因型、致病性和耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)UPEC具有遺傳多態(tài)性，其基因型與耐藥性

22、和毒力基因之間沒有顯著關(guān)系，而毒力基因與耐藥性呈顯著正相關(guān)，提示UPEC的耐藥性以水平向獲得為主。
　　3、利用高致病性、多重耐藥UPEC201菌株建立了UPEC尿路感染 Balb/c小鼠模型，并研究了扶正清熱利濕中藥對該模型的治療作用。關(guān)于中藥干預(yù)該模型的相關(guān)研究在國內(nèi)未見報道。
　　4、通過觀察分析治療后小鼠模型臟器內(nèi)未清除細(xì)菌的耐藥性及質(zhì)粒的變化，研究了扶正清熱利濕中藥治療對UPEC耐藥性的影響。結(jié)果顯示中藥治療后，U