RNAi沉默CD28基因小鼠淋巴瘤EL4細(xì)胞生物學(xué)行為影響的實驗研究.pdf

1、目的:構(gòu)建針對小鼠CD28的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)的慢病毒表達(dá)載體并篩選出高效的CD28/shRNA干擾序列,探討RNAi(RNAinterference,RNAi)沉默CD28分子對EL4細(xì)胞增殖及存活的的影響極其可能機制。
　　 方法:
　　 ①設(shè)計并合成3對靶向小鼠CD28的特異性干擾序列和1對非特異性對照序列,分別亞克隆至慢病毒載體pLB中,通過PCR及測序進行鑒定;

2、>　　 ②分別將重組質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,生產(chǎn)慢病毒顆粒,并依據(jù)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表達(dá)水平檢測病毒滴度;
　　 ③慢病毒顆粒感染EL4細(xì)胞后,用軟瓊脂板篩選出陽性克隆并擴增,實時熒光定量RT-PCR和Western blot技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白水平檢測CD28的表達(dá),并篩選出沉默效率最高的干擾序列;
　　 ④實驗分三組:對照組(不加任何

3、處理的EL4細(xì)胞)、抗體組(加入激活型CD28抗體的EIA細(xì)胞)、CD28/shRNA組(CD28沉默率最高的 EL4細(xì)胞)。通過MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖變化;經(jīng)血清饑餓法或地塞米松誘導(dǎo)72h后,采用Annexin V-PE/7-AAD雙染色法檢測各組細(xì)胞的凋亡情況;Western blot技術(shù)檢測各組細(xì)胞NF-κB p65和Bcl-xL的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 ①經(jīng)PCR及測序結(jié)果證實,成功構(gòu)建pLB-CD2

4、8/shRNA重組慢病毒質(zhì)粒,重組慢病毒滴度達(dá)108IU/mL;
　　 ②重組慢病毒顆粒感染EL4細(xì)胞后,特異性干擾組(pLB-CD28/shRNA1,2,3)CD28 mRNA和蛋白表達(dá)量均有明顯下降,mRNA表達(dá)量分別下降了71.94％、69.54％、91.83％,蛋白表達(dá)量分別下降了44.09％、39.78％、50.97％,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。其中pLB-CD28/shRNA3沉默效率最高,mRN

5、A水平下降了91.83％,蛋白水半下降了50.97％,而非特異性干擾組對EL4細(xì)胞CD28的表達(dá)無下調(diào)作用(P＞0.05);
　　 ③MTT法測定細(xì)胞增殖率顯示,CD28/shRNA組細(xì)胞于12h、24h、48h、72h、96h其A570OD值分別為0.701±0.063、1.175±0.040、1.695±0.063、2.137±0.109、2.414±0.111,與對照組(0.719±0.062、1.184±0.051、1.

6、738±0.044、2.147±0.098、2.447±0.099)相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05):而CD28 mAb組細(xì)胞于12h、24h、48h、72h、96h其A570 OD值分別為0.695±0.053、1.203±0.056、1.850±0.106、2.445±0.086、2.849±0.087,與對照組相比顯著增高(P＜0.05)。
　　 ④血清饑餓法誘導(dǎo)細(xì)胞72h后,對照組、CD28 mAb組、CD28/shRN

7、A組細(xì)胞凋亡率分別為(31.81±3.12)％、(22.24±3.12)％、(64.80±3.94)％,與對照組相比,CD28/shRNA組細(xì)胞凋亡明顯增多(P＜0.05),CD28 mAb組細(xì)胞凋亡明顯減少(P＜0.05);地塞米松誘導(dǎo)細(xì)胞72h后,對照組、CD28 mAb組、CD28/shRNA組細(xì)胞凋亡率分別為(43.25±3.92)％、(32.96±2.52)％、(54.87±3.37)％,與對照組相比,CD28/shRNA組細(xì)

8、胞凋亡明顯增多(P＜0.05),CD28 mAb組細(xì)胞凋亡明顯減少(P＜0.05);
　　 ⑤與對照組相比,CD28/shRNA組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)量無明顯變化(P＞0.05),CD28 mAb組NF-κB p65的表達(dá)量增高(P＜0.05);CD28/shRNA組Bcl-xL表達(dá)量明顯下降(P＜0.05),CD28 mAb組Bd-xL表達(dá)量明顯增多(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 ①成功構(gòu)建