慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi靶向沉默HSP70基因?qū)α馨土黾?xì)胞凋亡的影響.pdf

1、本文分析了慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi靶向沉默HSP70基因?qū)α馨土黾?xì)胞凋亡的影響。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：慢病毒載體介導(dǎo)綠色熒光蛋白對淋巴瘤細(xì)胞株轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化研究。
　　 目的：觀察淋巴瘤細(xì)胞株中慢病毒載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)移的效率，通過觀察不同轉(zhuǎn)染條件下慢病毒載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染效率實(shí)現(xiàn)對其轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，為進(jìn)一步研究慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾在淋巴瘤細(xì)胞中的應(yīng)用提供基本條件。
　　

2、方法：首先設(shè)計并合成帶綠色熒光蛋白的慢病毒載體顆粒，按細(xì)胞株（人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞株Raji、人彌漫大B淋巴瘤細(xì)胞株Ly8和人套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Sp53)、感染復(fù)數(shù)（MOI=1、10、30、50、60及100）、促轉(zhuǎn)染試劑(Polybrene和Enhanced Infection Solution)、轉(zhuǎn)染條件（離心和不離心）分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后在不同的時間點(diǎn)熒光顯微鏡下觀察淋巴瘤細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)情況，通過計算綠色熒光蛋白表達(dá)的

3、細(xì)胞比率，明確各轉(zhuǎn)染條件下的轉(zhuǎn)染效率,對人彌漫大B淋巴瘤細(xì)胞株Ly8進(jìn)行轉(zhuǎn)染后傳代培養(yǎng)，4周后流式細(xì)胞儀分析攜帶綠色熒光蛋白細(xì)胞的比率。
　　 結(jié)果：⑴細(xì)胞株，感染復(fù)數(shù)，促轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染條件均對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率有影響，Sp53細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率大于Ly8細(xì)胞株，它們的轉(zhuǎn)染效率均大于Raji細(xì)胞株；感染復(fù)數(shù)越大，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率越高，當(dāng)達(dá)到一定極限后，轉(zhuǎn)染效率不隨感染復(fù)數(shù)的增加而增加；Polybrene的促轉(zhuǎn)染效果大于Enhanced I

4、nfection Solution;對懸浮細(xì)胞來說，離心的轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于不離心的轉(zhuǎn)染效率，其結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在人套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Sp53中，感染復(fù)數(shù)為60，使用Polybrene為促轉(zhuǎn)染試劑時，轉(zhuǎn)染效率最高可達(dá)90％。⑵慢病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染入淋巴瘤細(xì)胞株后可穩(wěn)定傳代4周，4周后其轉(zhuǎn)染效率仍可達(dá)85.6％。
　　 結(jié)論：①慢病毒載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白對淋巴瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率在人套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Sp5

5、3中，感染復(fù)數(shù)為60，使用Polybrene為促轉(zhuǎn)染試劑時，轉(zhuǎn)染效率最高可達(dá)90％。②慢病毒載體介導(dǎo)的綠色熒光蛋白對淋巴瘤細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染可穩(wěn)定的傳代。
　　 第二部分：RNA干擾靶向沉默HSP70基因?qū)μ准?xì)胞淋巴瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　 目的：觀察靶向沉默HSP70基因?qū)μ准?xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Sp53細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，探討HSP70基因?qū)μ准?xì)胞淋巴瘤凋亡途徑的影響，為套細(xì)胞淋巴瘤的治療提供新的思路。
　　 方法：首

6、先設(shè)計并構(gòu)建針對HSP70基因的慢病毒干擾載體，然后按論文一所得出的最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件對套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Sp53進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染前后Sp53細(xì)胞中HSP70蛋白表達(dá)的變化。采用Annexin-V-PE熒光染料檢測靶向干擾HSP70基因?qū)μ准?xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Sp53凋亡的影響。
　　 結(jié)果：⑴HSP70慢病毒載體顆粒轉(zhuǎn)染套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Sp53后240小時，收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot，結(jié)果表明

7、，與空白Sp53組和陰性對照Sp53組相比，轉(zhuǎn)染HSP70慢病毒顆粒的細(xì)胞HSP70的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。這表明，設(shè)計合成針對HSP70的慢病毒載體顆?？梢栽谵D(zhuǎn)錄后水平抑制HSP70基因的表達(dá)。⑵慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染Sp53細(xì)胞后240小時，用PE標(biāo)記的Annexin-V-抗特異性結(jié)合凋亡細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察PE陽性細(xì)胞比率，即得到細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明，與空白Sp53組和陰性對照Sp53組相比，轉(zhuǎn)染HSP70慢病毒顆粒的細(xì)胞的凋亡