2型糖尿病差異表達microRNAs的鑒定及功能研究.pdf

1、microRNAs是由21-25個核苷酸組成的非編碼RNA，它通過與靶基因的3’-UTR的配對，促進mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯從而抑制其靶基因的表達，近年來，其與各種疾病的關系的研究成為熱點。2型糖尿病作為一種代謝性疾病，大量研究工作集中于2型糖尿病編碼蛋白的易感基因篩查和功能的鑒定，關于microRNAs與此疾病的關系知之甚少。本實驗以國際上公認的2型糖尿病模型—Goto-Kakizaki大鼠為實驗對象，用microRNAs芯

2、片篩查GK大鼠與健康對照Wistar大鼠的骨骼肌中差異表達的microRNAs。設定閥值1.5倍，SAM軟件分析找到15個差異表達的microRNAs，與健康對照組比較，其中上調的有4個(miR*29a、miR-29b、miR-29c和miR-150)，下調的有11個(miR-379、miR-127、miR-299-5p、miR-434-3p、miR-335、miR-130a、miR-19b、miR-451、miR-148a、miR-1

3、99a和miR-152)。Northern雜交驗證結果為，表達豐度較高的上調的四個microRNAs與芯片結果完全一致，下調的microRNAs中，如miR-152豐度較低，且與芯片結果不一致，其表達量在兩組間沒有差異；miR-130a、miR-19b和miR-434-3p與芯片結果一致，而其他下調的microRNAs則可能因豐度甚低，Northern雜交沒有檢測到信號。 依據(jù)高胰島素和高葡萄糖是2型糖尿病最典型的特征，我們在3

4、T3-L1脂肪細胞中，以高胰島素聯(lián)合高葡萄糖處理細胞24小時后，發(fā)現(xiàn)miR-29a和miR-29b的表達增加，而48小時后僅miR-29b的表達差異顯著，說明高胰島素和高葡萄糖是miR-29表達上調的一個誘因，但可能還有其他因素的作用。接著用腺病毒為載體高量表達miR-29，結果顯示，胰島素刺激葡萄糖吸收的增加受到抑制(50％)，而這種抑制作用可被miR-29的抑制劑處理細胞部分抵消，使上述抑制效率從50％降低至24％。免疫熒光的結果表

5、明，過表達miR-29使得胰島素誘導的GLUT4向細胞膜上的轉運受到了抑制。同時與高胰島素高葡萄糖作用于3T3-L1脂肪細胞產生的胰島素抵抗效應一樣，Akt的激活也受到抑制，雖然miR-29所產生的抑制程度不及后者顯著，但是綜合前面的結果我們可以得出miR-29的過量表達在細胞水平上能產生胰島素抵抗效應。測序分析miR-29的前體序列發(fā)現(xiàn)，僅miR-2962的前體序列有2個核苷酸的多態(tài)性，且位于前體的莖環(huán)結構區(qū)，但是克隆表達GK大鼠和對

6、照大鼠來源的pri-miR-29b2，經Northern雜交證實此多態(tài)性并不影響miR-29b2的加工成熟和表達。經生物信息學預測后克隆鑒定了pri-miR-29b2的啟動子區(qū)域，預測的啟動子序列在大鼠和小鼠內是完全一致的，且上游400bp處發(fā)現(xiàn)一個Myod的結合位點也是完全保守的。雖然此啟動子和Myod的結合位點在人類是不保守的，但是Northern雜交實驗同樣證明Myod可激活miR-29b和miR-29c的表達，后經生物信息學預測

7、發(fā)現(xiàn)，人的啟動子區(qū)域上游也存在2個相鄰的Myod的結合位點。因為胰島素能在骨骼肌細胞(C2C12和L6)中誘導Myod的表達，據(jù)此我們提出一個模型為：高胰島素刺激Myod的表達，后者則誘導miR-29b和miR-29c的表達。然而無論是高胰島素和高葡萄糖導致的miR-29b的表達上調，還是Myod誘導的miR-29b和miR-29c的表達增加均不能解釋2型糖尿病個體內miR-29家族三個成員的表達同時上調這一結果。 綜合前面的結