L-抗壞血酸對小鼠卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、獲取高質(zhì)量成熟的卵母細(xì)胞和胚胎是進(jìn)行人工輔助生殖和動物生產(chǎn)的關(guān)鍵。相對于體內(nèi)自然發(fā)育的條件，體外培養(yǎng)條件會導(dǎo)致卵母細(xì)胞和胚胎在成熟和發(fā)育過程中出現(xiàn)異常的表觀遺傳修飾，從而會導(dǎo)致卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育率以及發(fā)育質(zhì)量的下降，嚴(yán)重的甚至?xí)鹇涯讣?xì)胞和胚胎的死亡;維生素C是人類必需的營養(yǎng)物質(zhì)，最近的研究發(fā)現(xiàn)它能廣泛地影響表觀遺傳修飾，并且可以提高胚胎的發(fā)育率。然而，維生素C在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中的作用及其影響胚胎發(fā)育的機(jī)理仍有待研究。例如:

2、維生素C能否影響小鼠卵母細(xì)胞的發(fā)育率、提高小鼠卵母細(xì)胞和胚胎的發(fā)育質(zhì)量、改善因體外培養(yǎng)條件而帶來的異常的表觀遺傳修飾等。
　　本實驗利用卵母細(xì)胞和胚胎體外細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞免疫熒光、Western blot、實時熒光定量PCR等技術(shù)，檢測了維生素C對于小鼠卵母細(xì)胞和胚胎體外培養(yǎng)發(fā)育的影響，探討了L-Ascorbic acid對小鼠卵母細(xì)胞和胚胎體外培養(yǎng)最佳的處理濃度。主要實驗結(jié)果如下:
　　1.不同濃度的L-Ascorbic a

3、cid處理小鼠卵母細(xì)胞后，導(dǎo)致GVBD率都出現(xiàn)了下降;50ug/ml處理組顯著提高了第一極體排放率;100ug/ml處理組顯著降低了第一極體排放率;200ug/ml和1000ug/ml顯著降低了GVBD率;
　　2.免疫熒光結(jié)果顯示:100ug/mlL-Ascorbic acid處理卵母細(xì)胞，導(dǎo)致了染色體排列出現(xiàn)異常，排列較為松散;200ug/ml和1000ug/mlL-Ascorbic acid處理卵母細(xì)胞后，染色體排列出現(xiàn)了明

4、顯的異常，紡錘體組裝也出現(xiàn)了異常;
　　3.不同濃度的L-Ascorbic acid處理小鼠卵母細(xì)胞后，各個處理組甲基化蛋白DNMT1表達(dá)量均出現(xiàn)上升;100ug/ml處理濃度開始差異性顯著;小鼠卵母細(xì)胞5-mc免疫熒光結(jié)果圖顯示，200ug/ml和1000ug/ml處理均能顯著提高卵母細(xì)胞5-mc水平;
　　4.體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞紡錘體檢驗點蛋白BubR1低于體外培養(yǎng)的小鼠卵母細(xì)胞;50 ug/ml處理顯著性的降低體外培養(yǎng)卵

5、母細(xì)胞BubR1蛋白的表達(dá)量，接近于體內(nèi)BubR1蛋白的表達(dá)量;100 ug/ml處理組和1000ug/ml處理組著地降低了體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞紡錘體檢驗點相關(guān)蛋白BubR1蛋白的表達(dá)量;
　　5.不同濃度的L-Ascorbic acid處理對體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞通路蛋白P-ERK表達(dá)量的影響:50ug/mlL-Ascorbic acid處理組降低了P-ERK表達(dá)量;100ug/ml處理濃度開始，P-ERK蛋白的表達(dá)量顯著的上升;

6、　　6.RT-PCR結(jié)果顯示小鼠卵母細(xì)胞中主要起作用的去甲基化基因是TET3，不同濃度的L-Ascorbic acid處理小鼠卵母細(xì)胞后，甲基化基因DNMT1和去甲基化基因TET3的mRNA水平均上升;全能性基因Kif4的mRNA水平均下降;100ug/ml處理后OCT4mRNA水平高于對照組，但差異性不顯著;其他處理組mRNA水平均下降;
　　7.2cell時期體內(nèi)胚胎5-mc水平高于體外培養(yǎng)胚胎，5-hmc水平體內(nèi)胚胎顯著高于

7、體外培養(yǎng)胚胎;8cell、Morula、Blastula時期體外培養(yǎng)胚胎5-mc水平顯著高于體內(nèi)胚胎;8cell、Blastula時期體外培養(yǎng)胚胎5-hmc水平顯著高于體內(nèi)胚胎，Morula時期體外培養(yǎng)胚胎5-hmc水平高于體內(nèi)胚胎，差異不顯著;
　　8.Morula時期，體內(nèi)胚胎去甲基化基因TET2 mRNA水平要顯著高于體外培養(yǎng)胚胎; TET3主要在2cell時期起作用，體內(nèi)胚胎TET3 mRNA的水平顯著高于體外培養(yǎng)胚胎;<