生長(zhǎng)分化因子9對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟及早期胚胎發(fā)育的影響及機(jī)制研究.pdf

1、采用胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)，可以有效地利用屠宰場(chǎng)廢棄的動(dòng)物卵巢，大量廉價(jià)地在實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)胚胎，這對(duì)加速我國(guó)家畜良種繁殖具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。但目前豬卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎體外生產(chǎn)效率還比較低。GDF9作為一種重要的卵源旁分泌因子，具有促進(jìn)卵泡向雌性生殖方向發(fā)育，從而提高卵母細(xì)胞發(fā)育能力的作用。本研究通過(guò)向豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中單獨(dú)添加GDF9和抗GDF9抗體，從正反兩方面來(lái)探究GDF9對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的生物學(xué)作用，為豬胚胎的

2、體外生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下:
　　第一部分GDF9對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響
　　采集屠宰場(chǎng)廢棄的豬卵巢，收集COCs進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，44h后統(tǒng)計(jì)核成熟率，并對(duì)成熟卵母細(xì)胞用化學(xué)方法孤雌激活，48h后統(tǒng)計(jì)卵裂率，168h后統(tǒng)計(jì)囊胚率，并收集囊胚統(tǒng)計(jì)總細(xì)胞數(shù)。此外，收集培養(yǎng)44h的成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行皮質(zhì)顆粒染色，統(tǒng)計(jì)胞質(zhì)成熟率。在本次試驗(yàn)中，對(duì)未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行兩種處理，即在成熟培養(yǎng)液中分別加入GDF

3、9（濃度梯度為0，100，200，300 ng/mL）和抗GDF9抗體（濃度梯度為0，2.5，5，10μg/mL），然后檢測(cè)上述指標(biāo)。結(jié)果表明，GDF9對(duì)核成熟、胞質(zhì)成熟、卵裂及囊胚總細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著影響，但可顯著提高囊胚率，且這種作用具有劑量依賴(lài)性，在濃度為200ng/mL時(shí)達(dá)到最大。
　　第二部分GDF9對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟與發(fā)育微環(huán)境影響的研究
　　采集屠宰場(chǎng)廢棄的豬卵巢，收集COCs進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，44h后依據(jù)文獻(xiàn)方法

4、對(duì)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散情況進(jìn)行分析，并收集卵丘細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板對(duì)卵丘細(xì)胞增殖情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，收集成熟培養(yǎng)液，用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)液中孕酮含量。在本次試驗(yàn)中，選取對(duì)胚胎發(fā)育有顯著差異的添加物濃度:200ng/mL的GDF9和10μg/mL抗GDF9抗體分別加入豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中進(jìn)行處理，然后檢測(cè)上述指標(biāo)。結(jié)果表明，200ng/mL的GDF9可促進(jìn)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散、增殖，抑制孕酮分泌，從而抑制黃體化，創(chuàng)造適合卵子發(fā)育的微環(huán)境。
　　第三部

5、分GDF9對(duì)豬卵丘細(xì)胞基因表達(dá)的研究
　　采集屠宰場(chǎng)廢棄的豬卵巢，收集COCs進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，44h后收集卵丘細(xì)胞，抽提其總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，將HAS2（與卵丘擴(kuò)散相關(guān)）、CSTB（與囊胚發(fā)育相關(guān)）、FST（與卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育相關(guān)）基因與內(nèi)參基因ACTB同時(shí)進(jìn)行QPCR擴(kuò)增，記錄各個(gè)基因擴(kuò)增的的ct值。在本次試驗(yàn)中，與第二部分相同，選取對(duì)胚胎發(fā)育有顯著差異的添加物濃度:200ng/mL的GDF9和10μ g/mL抗