鴉膽子苦醇對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育的阻滯作用及其機(jī)制探究.pdf

1、哺乳動(dòng)物的早期胚胎發(fā)育的分子調(diào)控是生命科學(xué)研究的重要課題之一，是精細(xì)而又復(fù)雜的有序調(diào)控過(guò)程，包括受精卵的分裂、緊密態(tài)、桑葚胚和囊胚的形成。植入前胚胎的正常發(fā)育對(duì)胚胎著床及產(chǎn)生健康子代的十分重要，在此期間胚胎受到眾多蛋白因子的調(diào)控，任何基因表達(dá)異常都有可能導(dǎo)致受精卵發(fā)育障礙。雖然已有很多文獻(xiàn)報(bào)道哺乳動(dòng)物的植入前胚胎發(fā)育的相關(guān)研究，但是對(duì)于其潛在的分子機(jī)制仍不十分清楚。因此，研究可能影響胚胎發(fā)育的因素，對(duì)于揭示哺乳動(dòng)物生殖規(guī)律、改善胚胎質(zhì)量

2、以及預(yù)防出生缺陷提供新的理論基礎(chǔ)和臨床依據(jù)。
　　Nuclear factor E2-related factor2（Nrf2），是細(xì)胞內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，眾所周知的是調(diào)節(jié)著體細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)眾多抗氧化反應(yīng)，可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激和親電子化學(xué)物質(zhì)的抗性。生理?xiàng)l件下，含有Cul3泛素連接酶活性的Keap1可以降解Nrf2蛋白，Keap1-Nrf2體系使可誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)和細(xì)胞的生物能學(xué)協(xié)調(diào)的結(jié)合起來(lái)。中藥鴉膽子是一種常用的抗腫瘤中草

3、藥，鴉膽子苦醇(Brusatol)是來(lái)源于鴉膽子的主要成分，是一種Nrf2的天然抑制劑。本實(shí)驗(yàn)選用昆明小鼠植入前胚胎為實(shí)驗(yàn)材料，利用Brusatol抑制Nrf2蛋白表達(dá)，驗(yàn)證Nrf2在小鼠植入前胚胎發(fā)育中的表達(dá)，探究不同濃度的Brusatol對(duì)植入前胚胎發(fā)育潛能的影響，評(píng)估Nrf2對(duì)維持胚胎質(zhì)量過(guò)程中貢獻(xiàn)。
　　本課題研究用不同濃度Brusatol處理小鼠植入前胚胎的合子期細(xì)胞，觀(guān)察細(xì)胞在不同濃度下的發(fā)育率并篩出最佳濃度;應(yīng)用免疫

4、熒光檢測(cè)Nrf2蛋白在小鼠植入前胚胎發(fā)育的不同時(shí)期即2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、桑葚胚和囊胚的表達(dá)和定位;通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因及其激酶在2-細(xì)胞期胚胎的mRNA水平表達(dá)的變化并通過(guò)EdU檢測(cè)細(xì)胞周期;Western blot驗(yàn)證Brusatol對(duì)Nrf2蛋白表達(dá)的影響;再通過(guò)合子期添加Brusatol的同時(shí)過(guò)表達(dá)Nrf2激活質(zhì)粒證明Nrf2確實(shí)在其中發(fā)揮作用;最后通過(guò)γ-H2AX抗體染色分析細(xì)胞中DNA損傷程度。研究結(jié)

5、果表明Brusatol確實(shí)可以下調(diào)Nrf2蛋白的表達(dá)。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)從2-細(xì)胞期到囊胚期Nrf2主要定位在細(xì)胞質(zhì)并且富集在細(xì)胞核。不同濃度的Brusatol處理后細(xì)胞發(fā)育率隨濃度升高成負(fù)相關(guān)，用200nM Brusatol處理后幾乎沒(méi)有細(xì)胞發(fā)育到4細(xì)胞期，并且大部分細(xì)胞停滯在2-細(xì)胞期。我們進(jìn)一步用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組相比，Brusatol抑制劑組的Cyclin B及其激酶CDK1和CyclinE及其激酶CDK2以及其下游Rb

6、的mRNA水平均降低。γ-H2AX染色后熒光顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核并未被著色說(shuō)明Brusatol處理細(xì)胞可能不是通過(guò)DNA損傷來(lái)發(fā)揮作用。顯微注射后同時(shí)添加Brusatol后觀(guān)察細(xì)胞發(fā)育的潛能與只添加Brusatol組相比顯示恢復(fù)了部分發(fā)育潛能。
　　因此我們得出結(jié)論，在小鼠早期胚胎發(fā)育中Brusatol確實(shí)可以抑制Nrf2蛋白表達(dá)，并且結(jié)果表明抑制Nrf2表達(dá)可影響有絲分裂細(xì)胞周期，這可能是體外胚胎發(fā)育障礙的主要原因之一。Brus