不同培養(yǎng)介質(zhì)及冷凍方法對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟及胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、該研究以小鼠為研究對(duì)象,一方面系統(tǒng)研究表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor,EGF)、17 β-雌二醇(17beta-estradiol,17β-E<,2>)、丙酮酸及保留卵丘細(xì)胞對(duì)小鼠GV期卵母細(xì)胞體外成熟、受精及隨后早期胚胎發(fā)育的影響,以期優(yōu)化ⅣM培養(yǎng)基,為臨床提高人類卵母細(xì)胞成熟及受精后胚胎發(fā)育提供新的理論依據(jù).另一方面探討常規(guī)慢速冷卻/快速?gòu)?fù)溫及玻璃化法分別對(duì)GV及第二次減數(shù)分裂中期(Metaphase

2、Ⅱ,M Ⅱ)的卵母細(xì)胞復(fù)蘇、體外成熟、受精及早期胚胎發(fā)育的影響,旨在為卵母細(xì)胞的冷凍保存尋找最佳的時(shí)期和最佳的冷凍保存方法,為其更好的應(yīng)用于人類提供新的理論依據(jù).第一部分 表皮生長(zhǎng)因子、17β雌二醇、丙酮酸及卵丘細(xì)胞對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的影響 目的:探討培養(yǎng)液中添加表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、17β-雌二醇(17β-E<,2>)、丙酮酸及保留卵丘細(xì)胞對(duì)小鼠生殖泡期(GV)卵母細(xì)胞體外成熟、受精及其胚胎發(fā)育的影響.方法:GV期卵母細(xì)胞來(lái)自8

3、~12周、體重20~25g的昆明雌性小白鼠.將收集到的形態(tài)較好的GV期卵母細(xì)胞隨機(jī)分為5組:對(duì)照組:TCM199+10﹪胎牛血清+75IU/L FSH+0.5IU/ml hCG+0.05mg/ml青霉素+0.075mg/ml鏈霉素;EGF組:對(duì)照組液+10ng/ml EGF;17β-E<,2>組:對(duì)照組+1μg/ml 17β-E<,2>;丙酮酸組:對(duì)照液+0.3mM丙酮酸:EGF+17β-E<,2>+丙酮酸組:對(duì)照組液+10ng/ml

4、EGF+1μg/ml 17β-E<,2>+0.3mM丙酮酸.五組體外成熟液中,每組又分為卵丘細(xì)胞復(fù)合物(COC)及裸卵(DO)組.培養(yǎng)24小時(shí)后,對(duì)已排出第一極體的卵母細(xì)胞行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI),注射后4~5小時(shí),觀察卵母細(xì)胞受精情況,受精后繼續(xù)培養(yǎng)5~6天,觀察成熟率、受精率、卵裂率、2細(xì)胞、8細(xì)胞、桑椹胚及囊胚形成情況.第二部分 不同凍融方法對(duì)小鼠GV及MⅡ期卵母細(xì)胞的復(fù)蘇、體外成熟及胚胎發(fā)育的影響 目的:探討常規(guī)慢速

5、冷卻/快速?gòu)?fù)溫及玻璃化冷凍保存對(duì)GV及MⅡ期無(wú)卵丘卵母細(xì)胞凍融后存活及隨后卵母細(xì)胞體外成熟、受精和胚胎發(fā)育的影響.方法:GV及MⅡ期卵母細(xì)胞來(lái)自8~12周、體重20~25g的昆明雌性小白鼠.卵母細(xì)胞在100IU/ml的透明質(zhì)酸酶中通過(guò)機(jī)械吹打去除顆粒細(xì)胞,用兩種方法冷凍保存:常規(guī)方法(用丙二醇和蔗糖作為冷凍保護(hù)劑)及玻璃化方法(以乙二醇和蔗糖作冷凍保護(hù)劑)冷凍,在液氮中保存20~30天后解凍,以有正常的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)、透明帶完整、卵周隙小為