高氧吸入并機(jī)械通氣致支氣管肺發(fā)育不良的機(jī)制探討.pdf

1、隨著通氣策略的改變、產(chǎn)前糖皮質(zhì)激素及生后肺表面活性物質(zhì)的應(yīng)用，越來越多的早產(chǎn)兒和極低出生體重兒得以存活，但支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonarydysplasis，BPD)仍然存在，BPD是一種慢性肺疾病(Chroniclungdisease，CLD)，通常發(fā)生在患透明膜病、接受氧療、機(jī)械通氣治療的早產(chǎn)兒。目前多數(shù)人主張采用BPD命名，認(rèn)為此命名可清楚的區(qū)分多種原因?qū)е碌腃LD。早產(chǎn)兒BPD定義為生后28天或糾正胎齡(胎齡+

2、日齡)36周仍需吸氧者，此定義更能準(zhǔn)確地預(yù)測肺的預(yù)后。BPD臨床表現(xiàn)主要為患兒依賴吸氧，在原發(fā)病基本改善后仍需要機(jī)械通氣和吸氧，反復(fù)發(fā)生不易控制的肺部感染，呼吸困難明顯，易發(fā)生CO2蓄積和低氧血癥，肺功能指標(biāo)明顯下降，部分患兒并發(fā)肺動(dòng)脈高壓和心力衰竭。重者多于生后一年內(nèi)死于呼吸衰竭。存活兒也因肺功能障礙需長期(數(shù)月～數(shù)年)依賴氧氣或呼吸機(jī)治療，嚴(yán)重影響早產(chǎn)兒的生存質(zhì)量，因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍無有效的干預(yù)措施，因此探討高氧機(jī)械通氣致BP

3、D的發(fā)病機(jī)制已成為當(dāng)今新生兒領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。 根據(jù)病理學(xué)特點(diǎn)BPD大體上可分為兩種病變，一是炎性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的“傳統(tǒng)BPD”，表現(xiàn)為肺組織內(nèi)自細(xì)胞浸潤、肺氣腫、肺不張以及肺纖維化改變；二是肺發(fā)育阻滯為主要表現(xiàn)的“新型BPD”，表現(xiàn)為肺泡隔形成減少、微血管發(fā)育障礙、肺泡上皮增殖受抑制等。研究表明，氧自由基衍生物、炎癥反應(yīng)、機(jī)械通氣能夠損傷肺上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制表面活性物質(zhì)功能，抑制出生后肺泡、小呼吸道和小血管的發(fā)育

4、，從而影響肺的成熟。炎癥和氧自由基產(chǎn)物均可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilatorinducedlunginiury，VILI)是機(jī)械通氣過程中的一個(gè)嚴(yán)重并發(fā)癥，由氣壓傷、容積傷、不張傷及生物傷誘發(fā)肺損傷，隨后發(fā)生BPD。 肺發(fā)育由刺激和抑制因素之間的平衡引起，二個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)器是糖皮質(zhì)激素和轉(zhuǎn)化生長因子-β。近年來隨著轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1)的深入

5、研究，它在肺泡損傷、肺微血管發(fā)育受阻中的作用倍受關(guān)注。TGF-β1是調(diào)節(jié)肺發(fā)育、細(xì)胞分裂、細(xì)胞外基質(zhì)重建、呼吸道重建和調(diào)控炎癥的主要調(diào)控器，這些作用共同促進(jìn)BPD的發(fā)生，它參與肺損傷和修復(fù)相反兩方面的機(jī)制，即它誘導(dǎo)了凋亡、感染、纖維化和肺泡重塑。它和其他細(xì)胞因子相互影響，對(duì)肺的發(fā)生、發(fā)展起著重要的調(diào)控作用。 隨著人們對(duì)細(xì)胞凋亡在肺損傷機(jī)制中作用的關(guān)注，線粒體凋亡途徑成為目前研究的熱點(diǎn)，凋亡及其他形式的細(xì)胞死亡途徑中，線粒體通路是

6、一個(gè)關(guān)鍵性步驟，在多種死亡模型中細(xì)胞色素C(CcytochromeC，Cytc)從線粒體釋放至胞質(zhì)是引發(fā)凋亡的關(guān)鍵步奏。研究證實(shí)，肺組織細(xì)胞凋亡與急性肺損傷發(fā)生，發(fā)展密切相關(guān)，因此，探索早產(chǎn)兒BPD發(fā)生，發(fā)展中肺組織細(xì)胞的線粒體凋亡途徑規(guī)律及調(diào)控機(jī)制，不僅可以完善肺泡發(fā)育障礙的發(fā)生機(jī)制，并可尋求新的干預(yù)措施。 本實(shí)驗(yàn)利用新生兔BPD模型，觀察支氣管肺泡灌洗液(bronchialalveolarlavagefluid，BALF)白

7、細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺泡、肺微血管改變及肺泡II型上皮細(xì)胞凋亡的演變過程，同時(shí)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscription-polymerasechainraction，RT-PCR)及脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的X-dUTP缺口末端標(biāo)記(Terminaldeoxynucleotidetransferase-mediatedX-dUTPnickendlabeling,TUNEL)方法檢測肺組織TGF-β1、Cy

8、tc的蛋白及mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)及細(xì)胞凋亡指數(shù)，以探討①高氧吸入并機(jī)械通氣致BPD新生兔肺損傷的影響；②轉(zhuǎn)化生長因子β1在肺損傷機(jī)制中的雙重作用：③線粒體/細(xì)胞色素C凋亡途徑在肺組織細(xì)胞凋亡的作用。 實(shí)驗(yàn)材料及方法： 1.動(dòng)物模型 日齡3～5天的新生新西蘭兔96只，體質(zhì)量為58.4±9.9g。隨機(jī)取24只為為正常對(duì)照組，給予空氣吸入，未上呼吸機(jī)。余72只在西門子900C呼吸機(jī)上進(jìn)行機(jī)械通氣(Mechanicalve

9、ntilation.，MV)(定壓模式)，吸氧濃度為900ml/L，隨機(jī)分配在高吸氣峰壓(HPIP=2.45kPa)、中吸氣峰壓(MPIP=1.77kPa)、低吸氣峰壓(LPIP=0.98kPa)三組，每組24只，呼吸末正壓(Positiveendexpiratorypressale，PEEP)均為0.294kPa、呼吸頻率均為50次/min、吸氣時(shí)間均為0.33s。 2.標(biāo)本采集和實(shí)驗(yàn)方法 每組動(dòng)物分別于通氣開始后的1

10、、3、6小時(shí)(h)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只，切斷頸總動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，正常對(duì)照組也在相同時(shí)間點(diǎn)同樣處死，行左肺支氣管肺泡灌洗，用BALF作白細(xì)胞計(jì)數(shù)，中性分葉核細(xì)胞計(jì)數(shù)。取右肺中葉組織，RT-PCR檢測肺組織TGF-β1、CytCmRNA的表達(dá)。右肺下葉用來行免疫組織化學(xué)法檢測肺組織TGF-β1、CytC蛋白的表達(dá)，同時(shí)光鏡、電鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)改變及TUNEL法檢測肺組織細(xì)胞凋亡。 結(jié)果： 1.高氧并機(jī)械通氣對(duì)新生兔

11、一般狀態(tài)的影響 正常新生兔精神好，活動(dòng)好，反應(yīng)靈敏，呼吸平穩(wěn)，無發(fā)紺，膚色紅潤。通氣新生兔撤機(jī)后精神差，反應(yīng)差，肢體活動(dòng)少，出現(xiàn)不同程度呼吸困難和發(fā)紺，以低壓6h組明顯，其次是高壓6h組，中壓1h組癥狀最輕。 2.各組新生兔肺BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性分葉核細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化 隨著通氣的進(jìn)行，HPIP時(shí)肺組織反應(yīng)較強(qiáng)，BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)呈增加趨勢，6h最為明顯，均數(shù)最大，其次為LPIP，MPIP3h到6h呈下降趨勢，

12、HPIP中性分葉核細(xì)胞計(jì)數(shù)3h最高，LPIP6h明顯增高，結(jié)合病理切片肺微血管變化和肺纖維增生觀察結(jié)果，考慮高氧機(jī)械通氣致炎癥反應(yīng)可能是肺微血管損傷的一個(gè)始動(dòng)環(huán)節(jié)，由此導(dǎo)致的毛細(xì)血管閉塞是肺微血管減少的一個(gè)重要原因，成纖維細(xì)胞的異常增生也始于炎癥反應(yīng)最顯著階段。 3.病理結(jié)果 光鏡觀察：正常新生兔肺泡形態(tài)較規(guī)則，大小較一致，肺泡間隔無增厚。通氣新生兔早期微血管發(fā)生炎性反應(yīng)，隨時(shí)間延長，微血管炎性反應(yīng)加重，血管腔被中性粒細(xì)

13、胞浸潤和壞死的內(nèi)皮細(xì)胞堵塞，間質(zhì)出現(xiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，其周圍的成纖維細(xì)胞呈增生改變，最后產(chǎn)生大量膠原纖維、毛細(xì)血管閉塞，致使氣血屏障增厚，3h時(shí)肺泡腔稍擴(kuò)大，肺泡和毛細(xì)血管數(shù)目減少，6h時(shí)減少更明顯，肺泡腔變狹長，甚至出現(xiàn)肺泡分隔增寬，肺間質(zhì)細(xì)胞增多，毛細(xì)血管閉塞，以高壓力組明顯，低壓組次之，低壓力組以肺泡大小不均和萎陷、肺葉內(nèi)局部肺不張、透明膜形成較明顯。 電鏡觀察：正常新生兔肺微血管較豐富，血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整，基底膜連續(xù)，血

14、氣屏障結(jié)構(gòu)清晰，可見細(xì)胞連接。I、II型肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。通氣組1h血管擴(kuò)張，肺泡腔內(nèi)有紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，肺間質(zhì)內(nèi)可見多形核白細(xì)胞浸潤。6h時(shí)毛細(xì)血管明顯減少，血管基底膜增厚，部分血管腔被炎細(xì)胞堵塞，肺間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤增多，膠原纖維增生，肺泡腔變窄長，II型肺泡上皮細(xì)胞線粒體腫脹、板層小體破壞，II型肺泡上皮細(xì)胞向I型轉(zhuǎn)化及壞死。上述改變以高壓組及低壓組明顯，中壓組變化稍小，且低壓組肺泡腔受壓，變窄長，毛細(xì)血管閉塞較明顯。線粒體形

15、態(tài)的動(dòng)態(tài)變化與細(xì)胞凋亡同一時(shí)相。 4.肺組織TGF-β1蛋白含量及mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 通氣肺組織中TGF-β1mRNA1h增加，3h達(dá)高峰，高吸氣峰壓組水平最高，與其它組比較有意義，P<0.05。TGF-β1蛋白表達(dá)3h增加，6h達(dá)高峰，高吸氣峰壓組最顯著，四組間比較有顯著性差異，P<0.01。蛋白表達(dá)高峰稍遲于基因表達(dá)，TGF-β1蛋白表達(dá)灰度值(該值越低，表達(dá)越強(qiáng))與WBC呈負(fù)相關(guān)，r=-0.612,P=0.00

16、0，說明TGF-β1蛋白表達(dá)與WBC呈正相關(guān)關(guān)系。 5.肺組織CytC蛋白含量及mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 隨通氣時(shí)間延長，肺組織CytcmRNA表達(dá)增加及釋放增加，以高吸氣峰壓細(xì)胞牽張傷所致表達(dá)最顯著，隨時(shí)間延長低吸氣峰壓不張傷致CytcmRNA表達(dá)增高及Cytc釋放增加最明顯。Cytc蛋白表達(dá)與凋亡指數(shù)呈正相關(guān)，r=0.747，P=0.000。與WBC呈正相關(guān)，r=0.628，P=0.000。 結(jié)論： 1

17、.未成熟肺高氧機(jī)械通氣后出現(xiàn)肺泡分隔及數(shù)目減少、肺泡化程度減低、毛細(xì)血管減少到閉塞、肺纖維化的特點(diǎn)，且高吸氣峰壓細(xì)胞牽張傷所致?lián)p傷較重。 2.未成熟肺機(jī)械通氣后高吸氣峰壓細(xì)胞牽張傷致炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，隨時(shí)間延長，低吸氣峰壓不張傷致肺組織出現(xiàn)較重的炎癥性損傷。 3.高氧機(jī)械通氣氧化應(yīng)激致TGF-β1表達(dá)增高，以高吸氣峰壓最明顯，初期促進(jìn)肺泡及血管發(fā)育，進(jìn)而抑制。 4.未成熟肺高氧機(jī)械通氣后肺組織Cytc表達(dá)增高，以高吸