大鼠前包欽格復(fù)合體P-CaMKII及PBC患者肝組織LC3B和BECLIN1的表達(dá)及意義.pdf

1、本研究通過(guò)應(yīng)用免疫酶組織化學(xué)、免疫熒光組織化學(xué)及免疫電鏡技術(shù),觀察了大鼠前包欽格復(fù)合體磷酸化鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(phospho-Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II,P-CaMKII)和原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliarye cirrhosis,PBC)患者肝組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B和BECLIN1的表達(dá),并且探討了這些蛋白表達(dá)的生物學(xué)意義。
　　前包欽

2、格復(fù)合體位于延髓腹外側(cè),被認(rèn)為是呼吸節(jié)律的產(chǎn)生中樞。CaMKII在神經(jīng)元中廣泛表達(dá)且介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的各種生理過(guò)程。然而,很少有研究關(guān)注在前包欽格復(fù)合體中CaMKII的作用。本研究應(yīng)用神經(jīng)激肽-1受體(neuroknin-1 receptor,NK1R)作為前包欽格復(fù)合體標(biāo)記物,采用免疫酶組織化學(xué)、免疫熒光組織化學(xué)及包埋前免疫電鏡技術(shù),觀察了P-CaMKII在正常大鼠前包欽格復(fù)合體的表達(dá)。我們尤其關(guān)注P-CaMKII在NK1R免疫反應(yīng)神經(jīng)

3、元突觸后致密體(post-synaptic density,PSD)的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:光鏡下P-CaMKII免疫反應(yīng)的神經(jīng)元通常為橢圓形、紡錘形或錐形,P-CaMKII免疫反應(yīng)產(chǎn)物分布在胞體和突起,在966個(gè)NK1R免疫反應(yīng)神經(jīng)元中,63.7％(615/966)與P-CaMKII雙標(biāo)。電鏡下前包欽格復(fù)合體P-CaMKII和NK1R雙標(biāo)神經(jīng)元,免疫金顆粒代表P-CaMKII免疫反應(yīng),免疫過(guò)氧化物酶產(chǎn)物代表NK1R免疫反應(yīng),在胞體,有2

4、1個(gè)突觸檢測(cè)出P-CaMKII免疫反應(yīng),其中8(38.1%)個(gè)是對(duì)稱型突觸,其余為不對(duì)稱型突觸。然而,在樹(shù)突P-CaMKII免疫反應(yīng)大多數(shù)集中在不對(duì)稱型突觸,我們檢測(cè)了87個(gè)樹(shù)突,其中81(93.1%)是不對(duì)稱型突觸,僅有少量是對(duì)稱型突觸。部分突觸缺乏P-CaMKII免疫反應(yīng)。此外,在突觸周區(qū)域和突觸外區(qū)域也可觀察到 P-CaMKII免疫反應(yīng)。免疫過(guò)氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)物顯示 NK1R免疫反應(yīng),主要集中在突觸外區(qū)域,這與我們先前研究一致,在細(xì)

5、胞胞質(zhì)中也可觀察到 NK1R免疫反應(yīng)。P-CaMKII與NK1R可在前包欽格復(fù)合體共存。以上結(jié)果提示,P-CaMKII分布在胞體、突觸、突觸周區(qū)域和突觸外區(qū)域,在不同區(qū)域有不同功能,在樹(shù)突不對(duì)稱型突觸中 CaMKII可以感應(yīng)突觸后 Ca2+變化、磷酸化突觸后蛋白和調(diào)節(jié)興奮性突觸傳遞,而在胞體中 CaMKII同時(shí)作用于對(duì)稱和不對(duì)稱型突觸,調(diào)節(jié)興奮性和抑制性突觸傳遞,可能影響呼吸可塑性的調(diào)節(jié),為深入研究前包欽格復(fù)合體參與呼吸可塑性調(diào)控提供了

6、形態(tài)學(xué)依據(jù)。
　　PBC是一種以血清中抗線粒體抗體滴度增高,肝臟非化膿性小膽管炎癥和纖維化為特點(diǎn)的的自身免疫性肝臟疾病。在Sasaki M等的研究發(fā)現(xiàn)LC3B特異性表達(dá)于損傷小膽管上皮細(xì)胞內(nèi),自噬與PBC小膽管上皮細(xì)胞線粒體功能相關(guān),可能參與PBC膽管損傷的發(fā)病機(jī)制。以上研究只集中在膽管上皮細(xì)胞,在肝細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)明確自噬。我們的觀察發(fā)現(xiàn)在PBC患者的肝細(xì)胞中也存在明顯的自噬體,因此自噬在PBC肝細(xì)胞損傷中的作用值得進(jìn)一步研究。本研究

7、進(jìn)行了PBC患者的病例收集及相關(guān)指標(biāo)分析,運(yùn)用免疫組化、免疫熒光及電鏡技術(shù)觀察所收集病例肝臟組織中肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞自噬體的分布情況。結(jié)果顯示50例 PBC患者,堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GGT)有明顯升高,自噬相關(guān)蛋白 LC3B和BECLIN1在所選抗線粒體抗體(anti-mitochondria antibody,AMA