大鼠前包欽格復合體多巴胺-β-羥化酶免疫反應神經(jīng)纖維參與呼吸調(diào)控的形態(tài)學研究.pdf

1、目的：
　　前包欽格復合體(pre-B?tzinger complex, pre-B?tC)是產(chǎn)生呼吸節(jié)律的關鍵部位，與心血管功能相關的兒茶酚胺能 C1神經(jīng)元群共同位于大鼠延髓腹外側區(qū)（ventrolateral medulla, VLM）內(nèi)，且位置很大程度上重疊。研究已證明，VLM兒茶酚胺能神經(jīng)元的激活可以促進呼吸節(jié)律的發(fā)生，產(chǎn)生興奮性調(diào)節(jié)作用并刺激心跳活動，提示 C1和 pre-B?tC的神經(jīng)元，在心血管及呼吸活動過程中，可能

2、通過神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，共同參與呼吸功能的調(diào)控，但目前尚無形態(tài)學證據(jù)。pre-B?tC可以表達高水平的神經(jīng)激肽1受體（neurokinin1 receptor, NK1R)，如果同時損傷雙側80％以上的NK1R免疫反應(NK1R immunoreactive, NK1R-ir)陽性神經(jīng)元，可以嚴重干擾正常的呼吸節(jié)律，并導致血氣的異常，因此，在本實驗中，我們應用NK1R作為pre-B?tC的標志物來標記呼吸神經(jīng)元。C1細胞群屬于腎上腺素能神經(jīng)

3、元，是具有兒茶酚胺/谷氨酸（glutamate, Glu）雙重表型的神經(jīng)元，呈柱狀分布在VLM，主要參與病理情況下的呼吸-交感壓力敏感性調(diào)控及心血管的交感緊張性調(diào)控。去甲腎上腺素（norepinephrine, NE）可以通過作用于突觸后膜的α1腎上腺素能受體（adrenoreceptor, AR），影響呼吸活動。多巴胺-β-羥化酶（dopamine-β-hydroxylase, DβH）作為NE合成的關鍵酶，常用來反映NE的變化，Dβ

4、H-ir陽性不僅可以確定NE能神經(jīng)元的性質(zhì)、分布，而且在一定程度上，可根據(jù)免疫陽性產(chǎn)物量的多少及染色深淺確定NE能神經(jīng)元內(nèi)DβH水平、NE能神經(jīng)元的含量及其變化。因此，我們將DβH作為C1神經(jīng)元的特異性標志物，探討DβH-陽性的心血管相關C1神經(jīng)元與NK1R標記的pre-B?tC呼吸神經(jīng)元之間的突觸表型，從形態(tài)學角度闡述C1神經(jīng)元對呼吸的調(diào)控作用。
　　方法：
　　我們在應用常規(guī)的包埋前免疫電鏡染色方法時，標記的DβH-ir

5、神經(jīng)元不僅陽性胞體少，且突起纖細、稀疏，電鏡觀察效果較差。由于所用抗體相同，但在光鏡和電鏡下顯示出免疫標記結果的明顯差異性，考慮與大鼠腦干切片厚度及處理方式的不同影響了抗體的滲透能力有關。因此，我們用不同濃度的Triton X-100及不同液氮凍融次數(shù)處理各組切片，光鏡和電鏡下觀察比較不同方法對大鼠VLM C1區(qū)兒茶酚胺能神經(jīng)元DβH-ir標記結果的影響。在預實驗的基礎上，應用免疫熒光組織化學法免疫熒光雙標記顯示VLM的DβH-ir陽性

6、神經(jīng)元與NK1R標記的神經(jīng)元是否存在共定位，并利用納米金-銀加強免疫電鏡雙標記方法顯示二者在神經(jīng)元中的分布及突觸表型。
　　結果：
　　預實驗光鏡下觀察到DβH-ir產(chǎn)物分布于胞體和突起，清晰標記C1區(qū)神經(jīng)元。不同組間DβH-ir神經(jīng)元數(shù)量明顯不同，其中以0.05% Triton X-100組最為明顯，差異顯著。電鏡下結果顯示DβH-ir陽性顆粒主要分布在神經(jīng)元的胞體、樹突及軸突末梢內(nèi)，DβH-ir陽性軸突末梢與DβH-ir

7、陽性或陰性的胞體或樹突形成不對稱性突觸，部分形成密切接觸。免疫熒光實驗結果顯示：DβH-ir陽性神經(jīng)元主要位于 NK1R-ir陽性神經(jīng)元群的腹外側，與部分 NK1R-ir陽性神經(jīng)元相互重疊并形成密切接觸，二者之間的密切接觸通常存在于DβH-ir陽性神經(jīng)元突起與NK1R-ir陽性胞體和突起之間。免疫電鏡下觀察到：在 pre-B?tC，DβH-ir陽性神經(jīng)元的胞體、樹突和軸突末梢內(nèi)含有大量膠體金顆粒，以軸突末梢內(nèi)分布最密集，末梢內(nèi)可見小而清

8、亮的球形囊泡與密集的金顆粒摻雜分布。NK1R-ir陽性產(chǎn)物主要分布在 pre-B?tC神經(jīng)元細胞胞膜、樹突及細胞質(zhì)內(nèi)。在 pre-B?tC，DβH-ir軸突末梢主要形成不對稱性突觸，偶可見具有局部環(huán)路特征的對稱性突觸。研究表明含有小而清亮球形囊泡的不對稱性突觸，代表興奮性 Glu能神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，對稱性突觸通常接受抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的調(diào)節(jié)。提示C1神經(jīng)元主要以興奮性Glu的傳遞

9、為主，而突觸抑制對控制呼吸節(jié)律起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。電鏡下觀察到部分DβH-ir軸突末梢與NK1R-ir的神經(jīng)元形成不對稱性突觸，特別是與小梭形NK1R-ir陽性神經(jīng)元，即呼吸節(jié)律起搏神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系，表明呼吸節(jié)律的發(fā)生也接受兒茶酚胺能神經(jīng)纖維的調(diào)節(jié)。形態(tài)學證據(jù)首次證明pre-B?tC區(qū)產(chǎn)生吸氣節(jié)律的神經(jīng)元能夠接受兒茶酚胺興奮性的突觸傳遞。另外，NK1R-ir陽性突起還與DβH-ir陽性的胞體和樹突間形成密切接觸，但在電鏡下這種密切