羥基磷灰石納米介導NT-3基因治療豚鼠實驗性感覺神經(jīng)性耳聾的研究.pdf

1、NT-3是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能維持的重要物質(zhì)，是內(nèi)耳發(fā)育最基本的營養(yǎng)因子之一，并且對后天性損傷的神經(jīng)元有保護和促進恢復的作用。眾多研究已證實其對于內(nèi)耳興奮性損傷如缺血、噪聲損傷，以及氨基苷類耳毒性損傷等各種因素造成的耳蝸損傷有一定的保護和促進恢復的作用。前期研究已證實直接將NT-3蛋白通過微量滲透泵鼓階灌注可減輕谷氨酸對豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞興奮性毒性損傷?；蚩寺『突蜣D(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展讓內(nèi)耳基因治療前景廣闊．目前常用的基因載體有病毒載體中

2、的單純皰疹病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒載體和非病毒載體中的陽離子脂質(zhì)體，前期研究發(fā)現(xiàn)攜帶NT-3的重組腺病毒pAdeasy-NT-3對海人酸(KA)興奮性毒性所造成的耳蝸形態(tài)學損害有明顯的保護作用，但它們固有的一些缺陷如免疫原性和致癌性等讓其在臨床上的應(yīng)用必將受到限制。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米顆粒的獨特性質(zhì)使其作為非病毒載體的應(yīng)用逐漸受到重視，目前國內(nèi)外尚無納米顆粒內(nèi)耳基因治療的報道，首次嘗試用羥基磷灰石納米顆粒(HAT)做載體向靶細胞

3、轉(zhuǎn)染NT-3基因，研究體外細胞水平其在在小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的表達和對生長的影響，同時經(jīng)外淋巴灌注途徑向?qū)嶒炐陨窠?jīng)性聾豚鼠內(nèi)耳轉(zhuǎn)染NT-3基因，研究其在活體狀態(tài)下對耳蝸神經(jīng)元的保護作用，為非病毒載體介導的內(nèi)耳基因治療提供實驗依據(jù)。結(jié)果如下： 一、羥基磷灰石納米顆粒神經(jīng)營養(yǎng)素3轉(zhuǎn)運載體的構(gòu)建 l、重組質(zhì)粒pEGFPC2-NT3構(gòu)建 針對人的NT-3DNA序列，設(shè)計了包含起始密碼子和終止密碼子的一對引物，分別在其5’端

4、加上XhoI及Pst I限制性內(nèi)切酶酶切位點，PCR擴增NT-3目的基因，將pEGFPC2載體和PCR擴增片段分別用Xhol I和PstI限制性內(nèi)切酶雙酶切后連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌，篩選克隆雙酶切鑒定，送陽性克隆雙向測序證實重組質(zhì)粒pEGFPC2-NT3構(gòu)建成功。2、HAT結(jié)合保護DNA能力、生物相容性、轉(zhuǎn)染效率評價?；蜉d體最基本的條件就是DNA的結(jié)合和保護能力，為此進行了不同PH值及不同濃度HP與DNA結(jié)合實驗，發(fā)現(xiàn)

5、HAT在酸性和中性條件下能與pEGFPC<,2>-NT-3表達質(zhì)粒完全結(jié)合，但在堿性條件下不能與pEGFPC<,2>-NT-3結(jié)合。同時發(fā)現(xiàn)濃度過低時(≤125μg／ml)HAT混懸液與DNA結(jié)合能力稍差，在濃度為500μg／ml時與DNA完全結(jié)合，可能為最佳濃度。結(jié)合DNA后不能被DNase工消化，說明其具有保護DNA能力。將不同濃度的HAT(≤500μg／ml)與宮頸癌上皮細胞Hela共培養(yǎng)，應(yīng)用MTT實驗檢測其對宮頸癌上皮細胞He

6、la的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)其基本無細胞毒性。利用HAT介導帶有綠色熒光蛋白報告基因的pEGFPC<,2>-NT-3來檢測其體外轉(zhuǎn)染效率，通過在熒光顯微鏡下觀察發(fā)出綠色熒光的轉(zhuǎn)染陽性細胞，同時與脂質(zhì)體LP22000介導的同一基因的轉(zhuǎn)染效率比較，發(fā)現(xiàn)HAT比脂質(zhì)體L22000的轉(zhuǎn)染效率稍低，約15％。同時發(fā)現(xiàn)pEGFPC<,2>-NT-3融合蛋白在細胞的亞細胞定位，基本定位于細胞漿，與后期動物實驗中NT-3免疫組化在SGCs中表達一致。應(yīng)用Wes

7、tern-blot印跡分析方法，分別用NT-3抗體和GFP抗體檢測pEGFPC<,2>-NT-3融合蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)HAT和脂質(zhì)體均能介導pEGFPC<,2>-NT-3進入Hela細胞并表達，其條帶大小約為41KD，與GFP和NT-3(13.6KD)的大小之和一致。 二、HAT／pEGFPC<,2>-NT-3小鼠原代螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(SGCs)體外轉(zhuǎn)染實驗 1、小鼠的原代螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的體外培養(yǎng)及鑒定．

8、 成功進行小鼠的原代螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)2h后大多數(shù)SGCs已貼壁，呈典型的圓形，胞體透明，胞漿均質(zhì)，折光好。24h后可見突起細長的雙極神經(jīng)元細胞和三極神經(jīng)元細胞。12d后SGCs數(shù)目減少，但形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。用特異性的神經(jīng)元標志物抗鼠的NFP200的單克隆抗體鑒定，SP法AEC染色發(fā)現(xiàn)SGCs其胞膜和軸突染成鮮紅色，胞漿無明顯染色，與文獻報道基本一致，可明確為神經(jīng)細胞。 2、HAT介導pEGFPC2-NT

9、3轉(zhuǎn)染SGCs并表達及對細胞生長的影響 為了檢測HAT作為基因載體對神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)運能力，應(yīng)用帶有綠色熒光蛋白報告基因的pEGFPC<,2>-NT-3來檢測其體外轉(zhuǎn)染小鼠耳蝸原代培養(yǎng)SGCs效率，通過在熒光顯微鏡下觀察發(fā)出綠色熒光的轉(zhuǎn)染陽性細胞，同時與脂質(zhì)體L22000介導的同一基因的轉(zhuǎn)染效率比較，發(fā)現(xiàn)HAT比脂質(zhì)體LP2000的轉(zhuǎn)染效率稍低，約為15％。 同樣應(yīng)用Western-blot用NT-3抗體檢測pEGF

10、PC<,2>-NT-3融合蛋白在SGCs內(nèi)的表達，發(fā)現(xiàn)HAT和LP均能介導pEGFPC<,2>-NT-3進入SGCs并表達蛋白質(zhì)，其條帶大小約為41KD。 轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后12dSGCs計數(shù)比較，發(fā)現(xiàn)HAq、載體組(HAT／NT-3組)、122000載體組(LP／NT-3組)及空白組細胞數(shù)均下降，而前兩組較空白組輕，說明轉(zhuǎn)染NT-3對減輕SGCs的退行性變有效。 三、HAT介導pEGFPC2-NT3對豚鼠耳蝸實驗性興奮毒性

11、損害的保護作用 選擇經(jīng)豚鼠耳蝸鼓階底回灌注4 mm01／L海人酸(KA)10ul，發(fā)現(xiàn)灌注1h后ABR聽閾與術(shù)前比有顯著性差異，說明實驗性興奮毒性模型建模成功．在灌注KA后7d經(jīng)同一孔給予HAT或L22000介導的pEGFPC<,2>-NT-3，在給KA28d后再次檢測ABR，與給KA7d后比ABR聽閾降低，潛伏期縮短，振幅變大，而KA組(未給NT-3)ABR聽閾持續(xù)性提高，說明HAT和LP2000介導的NT-3基因進入耳蝸后起

12、到了阻抑興奮性遞質(zhì)KA對聽力的損傷作用，且HAT和LP兩組差別不大。 同時用免疫組化方法檢測NT-3在耳蝸組織中的表達及分布，在HAT和L22000介導的pEGFPC<,2>-NT-3導入豚鼠耳蝸后7d，可檢測到耳蝸SGCs內(nèi)NT-3蛋白的表達較正常空白對照組明顯增強，其胞漿內(nèi)均有強染色呈深棕色，同時與正常空白對照組比較可見螺旋神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目減少，形態(tài)改變，有空泡樣變。說明NT-3基因進入SGCs并獲表達，而KA對SGCs造成了