羥基磷灰石納米載體經(jīng)完整圓窗膜滲透途徑向內(nèi)耳轉(zhuǎn)染NT-3基因的研究.pdf

1、目的：探索用羥基磷灰石（HAT）納米載體經(jīng)完整圓窗膜滲透途徑向內(nèi)耳轉(zhuǎn)染NT-3基因的可行性；研究在易化劑作用下，圓窗膜對載體-基因復(fù)合物的通透性是否有明顯提高；觀察在易化劑作用下經(jīng)完整圓窗膜滲透途徑向內(nèi)耳轉(zhuǎn)染NT-3基因的過程對耳蝸結(jié)構(gòu)和聽覺功能的影響。 方法：選用健康純白短毛紅目豚鼠31只，透明質(zhì)酸提前處理組（Hya組，7只）、組胺提前處理組（His組，6只）為實驗組，以鼓階鉆孔組（Drill組，3只）、脂質(zhì)體-DNA轉(zhuǎn)染組（

2、Lip組，6只）、直接轉(zhuǎn)染組（PEI-HAT組，6只）和空白對照組（Blank組，3只）作為對照。實驗組應(yīng)用透明質(zhì)酸/組胺處理完整圓窗膜后，將含有PEI-HAT納米載體NT-3基因的明膠海綿放置圓窗膜上進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每組術(shù)前、術(shù)后監(jiān)測ABR及DPOAE。術(shù)后72h處死豚鼠，取外淋巴液、血及腦脊液進(jìn)行pEGFP-C2-NT3的PCR擴增及產(chǎn)物分析。通過改良的耳蝸基底膜硬鋪片法及冰凍切片法在熒光顯微鏡下觀察耳蝸轉(zhuǎn)染后的熒光表達(dá)。 結(jié)果：

3、與經(jīng)完整圓窗膜途徑的轉(zhuǎn)染比較，鼓階鉆孔法對耳蝸的結(jié)構(gòu)和聽力的損害稍大。通過對進(jìn)入外淋巴液中的pEGFP-C2-NT3進(jìn)行PCR擴增然后電泳檢測以判斷圓窗膜對載體-基因復(fù)合物的通透性，以在外淋巴液中檢出pEGFP-C2-NT3的PCR產(chǎn)物為陽性。通過檢測脂質(zhì)體介導(dǎo)NT-3基因經(jīng)完整圓窗膜轉(zhuǎn)染的通透性，左耳陽性比例為3/6（即6例樣本中有3例陽性）；用1mg/ml組胺處理圓窗膜后，檢測羥基磷灰石納米粒NT-3基因載體經(jīng)完整圓窗膜轉(zhuǎn)染的通透性

4、，外淋巴液中未檢出，僅在腦脊液中檢測到：用9.5mg/ml透明質(zhì)酸處理圓窗膜后，經(jīng)電泳檢測羥基磷灰石納米粒NT-3基因載體經(jīng)完整圓窗膜轉(zhuǎn)染的通透性，測出左耳外淋巴液陽性比例達(dá)6/7，對側(cè)耳也有檢出，比例為2/6，與鼓階鉆孔法的檢測率近似，但大部分顯示濃度低，而血液中未檢測到。幾組腦脊液電泳均顯示強陽性條帶。 結(jié)論： （1）經(jīng)完整圓窗膜滲透途徑向內(nèi)耳轉(zhuǎn)染治療基因是可行的，而且是一種簡便、有效、少創(chuàng)傷的方法； （2）