納米羥基磷灰石介導靶向端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶RNA干擾的肺癌基因治療的實驗研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 實驗一:端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶siRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、抽提及鑒定
　　 目的：制備可供基因轉(zhuǎn)染的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶siRNA表達質(zhì)粒。
　　 方法：設計靶向hTERT基因干擾序列GCATTCCTGCTCAAGCTGA，合成兩條互補的單鏈DNA，排列次序如下：BamHⅠ酶切位點、正義序列、loop環(huán)、反義序列、RNA聚合酶Ⅲ終止子，Sa1Ⅰ酶切位點以及HindⅢ酶切位點。合成的寡核苷酸退火；采

2、用BamHⅠ以及HindⅢ雙酶切pGenesiL-1表達載體，切膠回收線性化載體；退火產(chǎn)物與線性化pGenesiL-1質(zhì)粒表達載體相連接；構(gòu)建hTERT-siRNA重組質(zhì)粒。采用CaCl2法制備感受態(tài)菌，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，抽提的重組質(zhì)粒進行Sa1Ⅰ以及PstⅠ單酶切并行凝膠電泳分析，通過測序鑒定以確定插入的干擾片段的準確性，確認針對hTERT基因的siRNA表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。用堿裂解法大量抽提，檢測質(zhì)粒的純度和濃度。
　　

3、 結(jié)果：BamHⅠ以及HindⅢ雙酶切pGenesiL-1表達載體，電泳可見約4800bp的線性化的質(zhì)粒條帶。重組質(zhì)?？杀籗a1Ⅰ酶切出一條約400bp的DNA條帶，無法被PstⅠ酶切；陰性對照質(zhì)粒無法被Sa1Ⅰ酶切，能夠被PstⅠ酶切出一條約400bp的DNA條帶。測序表明目的序列準確地插到預計的位點。五次質(zhì)粒大量抽提pGenesil-hTERT的A260/A280均在1.8～2.0間，濃度為1.30μg/μl～1.77μg/μl。<

4、br>　　 結(jié)論：設計合成的RNA干擾序列準確地克隆到pGenesiL-1表達質(zhì)粒中，靶向hTERT基因的siRNA表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。該載體可為深入研究端粒酶在腫瘤細胞中的作用機制提供新的手段。大量抽提的pGenesil-hTERT純度和濃度均能滿足基因轉(zhuǎn)染的要求。
　　 實驗二:納米羥基磷灰石表面修飾及與DNA的結(jié)合
　　 目的：應用多聚賴氨酸表面修飾納米羥基磷灰石，研究納米羥基磷灰石表面修飾及與DNA結(jié)合的可行性。

5、
　　 方法：采用超聲輔助均相沉淀法制備納米羥基磷灰石。透射電鏡觀察納米粒結(jié)構(gòu)。分別在不同pH環(huán)境下進行納米羥基磷灰石 (nHAP)的多聚賴氨酸 (PLL)修飾。檢測nHAP及nHAP-PLL的Zeta電位。采用離心后測上清液DNA濃度及核酸酶消化實驗考察PLL修飾后的nHAP結(jié)合、保護DNA的能力。
　　 結(jié)果：透射電鏡下nHAP粒徑比較均勻，約(15～20)nm×(60～80)nm左右，分散程度良好。nHAP經(jīng)Na2

6、CO3預處理后在pH 7.4及pH 7.6下可獲得較理想的的PLL修飾效果。nHAP的Zeta電位為(－42.4±7.5)mV，nHAP-PLL的Zeta電位為(8.5±1.5)mV，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)。DNA結(jié)合及抗核酸酶保護實驗顯示nHAP-PLL和DNA質(zhì)量比達20：1時，nHAP-PLL可有效結(jié)合并保護相應DNA。
　　 結(jié)論：超聲輔助均相沉淀法制備的羥基磷灰石為納米級顆粒，粒徑較小且均勻、分散程

7、度良好。納米羥基磷灰石經(jīng)Na2CO3預處理后可以進行多聚賴氨酸表面修飾。經(jīng)多聚賴氨酸表面修飾的納米羥基磷灰石可以有效結(jié)合并保護DNA。
　　 實驗三:納米羥基磷灰石介導人肺癌A549細胞體外基因轉(zhuǎn)染
　　 目的：探討經(jīng)多聚賴氨酸修飾的納米羥基磷灰石介導人肺癌A549細胞基因轉(zhuǎn)染的可行性。
　　 方法：根據(jù)實驗二的方法配制nHAP-PLL-DNA復合物。實驗分為nHAP-PLL組、脂質(zhì)體組及對照組，分別配制轉(zhuǎn)染復合

8、物并轉(zhuǎn)染A549細胞。熒光顯微鏡觀察EGFP的表達；流式細胞儀檢測pGenesiL-1的轉(zhuǎn)染率。
　　 結(jié)果：nHAP-PLL組和脂質(zhì)體組均見EGFP表達陽性的A549細胞，對照組未見EGFP表達陽性的A549細胞；nHAP-PLL組pGenesiL-1轉(zhuǎn)染A549細胞的轉(zhuǎn)染率為(31.8±1.9)%，與脂質(zhì)體組的轉(zhuǎn)染率 (33.4±3.7)%差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.01)，對照組未見轉(zhuǎn)染陽性的A549細胞。
　　

9、結(jié)論：納米羥基磷灰石經(jīng)多聚賴氨酸表面修飾后可介導人肺癌A549細胞體外基因轉(zhuǎn)染，有望成為一種新型的基因轉(zhuǎn)染載體。
　　 實驗四:納米羥基磷灰石介導靶向端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶RNA干擾對人肺癌A549細胞的影響
　　 目的：探討納米羥基磷灰石介導靶向端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶RNA干擾對人肺癌A549細胞的影響。
　　 方法：根據(jù)實驗二的方法配制nHAP-PLL-DNA復合物。實驗分為nHAP-PLL組、脂質(zhì)體組、nHAP組及對照組，

10、分別配制轉(zhuǎn)染復合物并轉(zhuǎn)染A549細胞。四唑鹽 (MTT)法測定細胞生長活力；應用RT-PCR及Western Blot檢測各實驗組A549細胞hTERT mRNA及蛋白表達，TRAP-ELISA檢測端粒酶活性；流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　 結(jié)果：nHAP-PLL組、脂質(zhì)體組與nHAP組A549細胞的增殖受到抑制。nHAP-PLL組、脂質(zhì)體組與nHAP組細胞增殖較對照組差別有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)；nHAP-PLL組抑制

11、細胞增殖較脂質(zhì)體組及nHAP組明顯，差別均有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。各組的hTERT mRNA、蛋白表達及端粒酶活性的變化趨勢與A549細胞的增殖情況檢測結(jié)果一致。流式細胞儀檢測nHAP-PLL組、脂質(zhì)體組、nHAP組及對照組細胞凋亡率分別是(28.1±1.4)%，(19.2±1.3)%，(10.9±1.2)%與 (0.3±0.2)%。nHAP-PLL組、脂質(zhì)體組及nHAP組均能誘導A549不同程度細胞凋亡，凋亡率與對照組差別有統(tǒng)