脂質(zhì)體介導(dǎo)的bFGF-Math1基因在UEC-4細胞中的表達及誘導(dǎo)分化作用.pdf

1、內(nèi)耳毛細胞是機械-電能轉(zhuǎn)換器，在維持聽覺和平衡覺方面有著至關(guān)重要的作用。任何原因引起的內(nèi)耳毛細胞變性、壞死、缺失等均可引起感音性聾或平衡功能障礙。因此，如何能使毛細胞再生一直是耳科工作者研究的重點。 近20年的研究表明許多細胞因子對毛細胞的再生有促進作用，這些因子包括表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、腦源性生長因子(BDNF)、胰島素樣生長因子(IGFs)等等。其中，bFGF是研究最多的一種生長因子。b

2、FGF具有廣泛的生物學(xué)作用，對體外培養(yǎng)的胚胎神經(jīng)細胞有促生長、分化的作用。多項研究表明bFGF對損傷后的毛細胞再生有促進作用。 毛細胞再生過程可能是胚胎期毛細胞分化成熟過程的再現(xiàn)。再生可能是因為毛細胞損傷后啟動了其前體細胞或干細胞向毛細胞的轉(zhuǎn)化或分化。近年來的研究發(fā)現(xiàn)許多“堿性螺旋-環(huán)-螺旋”(basichelix-loop-helix，bHLH)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對于內(nèi)耳毛細胞的發(fā)育成熟具有至關(guān)重要的作用。其中Math1基因被認

3、為是毛細胞分化成熟的必須基因。敲除Math1基因的小鼠內(nèi)耳不能形成毛細胞；在新生大鼠內(nèi)耳過表達Math1基因后在非感覺上皮區(qū)產(chǎn)生了異位的毛細胞。最新的證據(jù)表明Math1基因?qū)霊c大霉素致聾的成年豚鼠耳蝸后可以誘導(dǎo)毛細胞再生并伴有聽功能的部分恢復(fù)。 UEC-4細胞是Gao等利用SV40大T抗原建立的大鼠前庭橢圓囊支持上皮細胞系，被認為可能是前庭毛細胞的前體細胞之一，體外培養(yǎng)時，在bFGF存在條件下可以表達早期毛細胞標(biāo)記物-鈣視網(wǎng)膜

4、蛋白和鈣調(diào)蛋白，但不能表達毛細胞特異性標(biāo)記物-肌球蛋白Ⅶa(MyosinⅦa)。 為探討毛細胞再生的機制以及進一步研究bFGF-Math1基因的生物學(xué)作用，我們將該基因?qū)險EC-4細胞進行研究。主要結(jié)果如下： 一、轉(zhuǎn)染方法的選擇和優(yōu)化我們利用增強型綠色熒光蛋白基因(EGFP)作為報告基因比較了最常用的磷酸鈣法、Fugene6以及脂質(zhì)體介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)染率。結(jié)果顯示脂質(zhì)體法效率最高且穩(wěn)定重復(fù)性好，經(jīng)優(yōu)化后轉(zhuǎn)染率可高達40-56

5、％，是體外研究基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種有效方法。 二、bFGF-Math1基因在UEC-4細胞表達的檢測 將bFGF-Math1基因?qū)險EC-4細胞后，我們利用RT-PCR的方法分別檢測了轉(zhuǎn)染后24h，48h，72h，96h基因的表達情況。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后24h即有表達，48h，72h，96h后均表達良好，且表達較24h時強烈。 三、bFGF-Math1基因?qū)EC-4細胞的誘導(dǎo)分化作用 本研究發(fā)現(xiàn)bFGF-Ma

6、th1基因?qū)險EC-4細胞24h后，細胞形態(tài)開始發(fā)生改變，胞體變狹長，而非多角形形態(tài)。免疫組織化學(xué)法染色顯示：轉(zhuǎn)染24h后即有細胞開始表達MyosinⅦa，48h，72h，96h后表達MyosinⅦa的陽性細胞數(shù)量增多，與RT-PCR結(jié)果相吻合。而單純轉(zhuǎn)染Math1基因、bFGF基因以及空白對照組的UEC-4細胞在轉(zhuǎn)染后24-96h均未見MyosinⅦa陽性表達。 本研究利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法成功地將bFGF-Math1基因?qū)險E