Syndecan-4在bFGF誘導(dǎo)人系膜細(xì)胞增殖中的表達(dá)及作用的研究.pdf

1、腎小球系膜細(xì)胞的過度增殖是許多腎臟疾病的共同病理表現(xiàn),而且常伴有細(xì)胞外基質(zhì)的增多.隨著病程的進(jìn)展,嚴(yán)重影響了腎小球的濾過功能.部分病人因此進(jìn)展為腎小球硬化.近年來,腎小球系膜細(xì)胞增殖相關(guān)的機(jī)制探討已經(jīng)成為腎臟領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).syndecan-4是一種跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,其通過胞外區(qū)的硫酸乙酰肝素鏈可結(jié)合多種生長(zhǎng)因子或細(xì)胞外基質(zhì)成分,從而參與如生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)功能.Yung S等研究了syndecan-4在腎臟

2、疾病中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)syndecan-4 mRNA和蛋白在增殖性腎炎上調(diào);另有研究表明系膜細(xì)胞的增殖最初出堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic:fibroblast growth factor.bFGF)啟動(dòng),通過自身分泌的血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)繼續(xù)維持增殖進(jìn)程,提示腎小球系膜細(xì)胞過度增殖可能與syndecan-4和bFGF的作用有關(guān).但syndecan-4是否在bFGF誘導(dǎo)

3、人腎小球系膜細(xì)胞(humanmesangial cell,HMC)增殖中起到重要作用,至今國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道.因此,我們開展了以下研究: 目的：1、研究syndecan-4在人腎小球系膜細(xì)胞株上的表達(dá)及分布.2、研究bFGF刺激前后HMC中syndecan-4含量、細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的變化.3、通過RNA干涉技術(shù)下調(diào)系膜細(xì)胞syndecan-4的表達(dá),研究其是否抑制了bFGF引起的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng),同時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)syndecan-

4、4、PKCα基因表達(dá),探討其與bFGF的關(guān)系,闡明syndecan-4在bFGF誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖中的作用. 方法： 1、應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測(cè)}tMC的syndecan-4基因含量,免疫熒光及組化在蛋白水平上了解syndecan-4在HMC細(xì)胞上的表達(dá)及分布.2、設(shè)計(jì)并合成三條syndecan-4 RNA小干擾片段(Small interference RNA,siRNA),轉(zhuǎn)染細(xì)胞后應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中的

5、syndecan-4基因含量,篩選最佳干擾效率的siRNA片斷.3、應(yīng)用外源性bFGF刺激人腎小球系膜細(xì)胞,通過MTT檢測(cè)HMC細(xì)胞增殖的劑量-效和時(shí)-效關(guān)系,篩選最佳刺激濃度的bFGF.4、設(shè)立三個(gè)細(xì)胞組并進(jìn)行相應(yīng)干預(yù),分別為:空白組(無bFGF刺激)、bFGF組(有bFGF刺激)、siRNA組(bFGF刺激前進(jìn)行syndecan-4 siRNA干擾),在不同時(shí)間點(diǎn)用熒光定量PCR檢測(cè)三組的syndecan-4、PKCα僅含量,M1T

6、r檢測(cè)細(xì)胞增殖、ELISA檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)(纖維連接蛋白FN、Ⅳ型膠原、Ⅰ型膠原). 結(jié)果：1、以DAPDH為內(nèi)參,熒光定量PCR顯示人腎小球系膜細(xì)胞株每百萬看家基因中的Syndecan-4平均含量分別為4.52E+05,免疫熒光及免疫組化提示Syndecan-4在腎小球系膜細(xì)胞漿及細(xì)胞膜上均有表達(dá). 2、結(jié)果顯示針對(duì)人類syndecan-4 mRNA 400靶位合成的Syndecan-4siRNA2基因靜默效果最強(qiáng).40

7、0位點(diǎn)siRNA:Sense strand:5'-GAGUGAGGAUGUGUCCAACtt-3',Antisense strand:5'-GUUGGACACAUCCUCACUCtt-3'; 3、bFGF對(duì)HMC有顯著的的促增殖作用,增殖效應(yīng)總體以20ng/ml劑量組作用48h最好. 4、(1)熒光定量PCR顯示:bFGF組syndecan-4 mRNA表達(dá)12h內(nèi)短暫下降,而后隨著bFGF刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升,在36

8、h達(dá)到最高峰.siRNA組HMC中syndecan-4 mRNA表達(dá)顯著下降,24h時(shí)到達(dá)最低值,隨后逐漸恢復(fù),在24h至60h含量均顯著小于bFGF組含量,并在36h均值與bFGF組達(dá)到最大差異[(0.98±0.13)×105 VS(8.16±0.68)×105,P<0.01].syndecan-4 mRNA表達(dá)在bFGF刺激36h后顯著高于無bFGF刺激的空白組[(8.16+0.68)×105 VS(4.92±0.33)X 105,

9、P<0.01]. (2)PKCα mRNA熒光定量PCR結(jié)果表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì),在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)后,bFGF組PKCα mRNA表達(dá)隨著bFGF刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升,在36h達(dá)到最高峰.siRNA組HMC中PKCα mRNA表達(dá)顯著下降,24h時(shí)到達(dá)最低值,隨后逐漸回升,在0h至48h含量均顯著小于bFGF組含量,并在36h均值與bFGF組達(dá)到最大差異[(2.23土0.11)×103 VS(8.47±0.24)×103,P<0.

10、01].PKCα mRNA表達(dá)在bFGF刺激36h后顯著高于無bFGF刺激的空白組[(8.47±0.24)×103 VS(4.68±0.32)×103,P<0.01]. (3)MTT結(jié)果顯示bFGF刺激組比空白組增殖速度加快,36h、48h、60h均與空白組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,48h時(shí)兩組OD值均數(shù)相差最大(0.423±0.028vs 0.301±0.043,P<0.01),但siRNA阻斷后,減弱了bFGF的促增殖效應(yīng),在48h

11、siRNA組和bFGF組的均數(shù)相差最明顯(0.3304±0.013 vs 0.423±0.028,P<0.01),增殖抑制率達(dá)到22.1﹪. (4)ELISA顯示隨著bFGF作用時(shí)問的延長(zhǎng),HMC分泌的FN逐漸增加,在24h至72h均與空白組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Ⅳ型膠原在72h、96h比空白組顯著升高,syndecan-4 siRNA轉(zhuǎn)染HMC細(xì)胞后,可以顯著抑制同期FN、Ⅳ型膠原分泌.I型膠原變化無明顯差異. 結(jié)論：