胰腺發(fā)育相關(guān)maf基因在β細胞前體誘導分化過程中的表達變化.pdf

1、研究背景與目的：隨著胰島移植治療糖尿病的逐步開展和深入，供體的缺乏成為一個關(guān)鍵問題，體外獲得胰島素分泌細胞成為當務之急。胰腺導管上皮作為重要的β細胞前體來源，引起了越來越多的重視。近來有很多研究從胰腺導管上皮體外經(jīng)刺激因子誘導得到了分泌胰島素的類胰島細胞。在這一過程中，胰腺發(fā)育相關(guān)的許多轉(zhuǎn)錄因子的表達水平都發(fā)生了相應的變化，這些與胰腺發(fā)育內(nèi)分泌細胞分化成熟相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子包括ngn3，pdx-1，neuroD1，Pax6，nkx6.1等，

2、迄今對于這些基因的研究已經(jīng)比較成熟。而最新在胰島中鑒定出來的調(diào)控胰島素表達的轉(zhuǎn)錄因子mafa，及其家族成員mafb，c-maf在此過程中的表達還不清楚。先前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)maf蛋白家族亞群——大maf蛋白包括mafa，mafb，c-maf，NRL在機體很多組織如晶狀體，腦，腎，免疫組織中普遍表達并調(diào)控細胞發(fā)育分化，目前研究表明在胰島中負責調(diào)控胰島素的表達和內(nèi)分泌細胞的發(fā)育。為探索maf基因（主要是mafa，mafb，c-maf）在導管來源

3、的β細胞前體體外誘導發(fā)育過程中的表達變化，首先檢測作為β細胞前體的胰腺導管上皮中是否有maf系列基因的表達，進而在動物實驗和原代細胞實驗基礎(chǔ)上檢測它們的動態(tài)表達變化，參照maf與其他經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子的表達變化，可以更深入全面的理解胰腺發(fā)育通路及其中的關(guān)鍵基因，并找出更合適的干預切入點，實現(xiàn)體外成功獲得可移植β細胞的目標。 材料與方法：首先利用顯微切割技術(shù)獲得高純度小鼠胰腺原位導管上皮細胞，胰島細胞及外分泌組織細胞作為三組標本，通過r

4、eal-time PCR檢測三組中mafa，mafb，c-maf的mRNA表達情況。進而建立高脂肥胖的C57BL小鼠動物模型，建模結(jié)束后檢測血清生化指標，進行葡萄糖耐量試驗和胰島素耐量試驗，確定存在胰島素抵抗基礎(chǔ)上處死小鼠取胰腺制備切片，進行冰凍切片顯微切割，獲得胰腺導管上皮和胰島細胞標本，利用熒光定量PCR對三個maf基因mRNA水平進行相對定量。最后通過小鼠導管上皮細胞原代分離，體外培養(yǎng)實現(xiàn)擴增，然后經(jīng)表皮生長因子EGF，成纖維細胞

5、生長因子rFGF聯(lián)合作用誘導分化獲得類胰島細胞團。采誘導后3天，5天，7天時間點標本及顯微切割獲得的未誘導導管上皮細胞進行熒光實時定量，同時對三個時間點的細胞免疫組化染色鑒定胰島素是否表達。實時定量待檢基因包括maf及一些與胰腺發(fā)育分化有關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，得到它們在誘導前后的表達變化，探討maf在胰島細胞發(fā)育中的可能作用以及與其他基因的相互關(guān)系。 結(jié)果： 1）區(qū)別于外分泌組織，胰腺導管上皮和胰島細胞中均有mafa，maf

6、b，c-maf的表達，且c-maf在導管上皮中的表達高于胰島。 2)在肥胖激活體內(nèi)導管上皮細胞分化的前提下，對比于正常對照組，胰島中maf的表達沒有發(fā)生明顯變化，而在導管上皮中，c-maf在肥胖組的表達明顯高出正常對照組十幾倍之多，mafa，mafb并沒有明顯變化。 3)胰腺導管上皮經(jīng)體外成功誘導后，3天，5天，7天時免疫組化試驗顯示胰島素陽性，maf的表達出現(xiàn)了較為復雜的變化過程。Mafa在7天時出現(xiàn)了表達的升高，而之

7、前基本沒有變化；mafb在誘導前期逐漸升高，5天時出現(xiàn)高峰，而后于7天時表達水平回落；c-maf在誘導3天時表達水平最高，之后逐漸走低，7天時的狀態(tài)甚至低于為導管上皮。 結(jié)論：在胰腺發(fā)育過程中，c-maf可能側(cè)重于調(diào)節(jié)分化，在發(fā)育前期起作用，mafb則既有促分化也有保持功能的作用，所以其表達可能貫穿發(fā)育和成熟始終。而mafa的結(jié)論不甚明朗，關(guān)于mafa調(diào)節(jié)insulin轉(zhuǎn)錄的作用基本沒有異議，但其在導管及誘導前期的表達水平是否對