脂質(zhì)體介導綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞的實驗研究.pdf

1、目的：探討脂質(zhì)體介導增強型綠色熒光蛋白(EGFP)轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞的最佳條件，轉(zhuǎn)染的NSCs移植入正常大鼠側(cè)腦室后，EGFP作為神經(jīng)干細胞示蹤劑的效果，為NSCs作為基因治療載體提供實驗依據(jù)，同時為轉(zhuǎn)染其它功能基因奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)從胎鼠、新生大鼠、成年大鼠海馬中分離NSCs，采用NSC克隆懸浮法，選用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，添加劑B27，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)及表皮細胞生長因子(EGF)進行體外擴增培養(yǎng)，

2、采用免疫細胞化學法檢測NSC標志物Nestin的表達及分化后細胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和2，3-環(huán)核甘酸磷酸二脂酶(CNP)的表達。(2)胎鼠神經(jīng)干細胞離體后存活時間研究：在下列時間點進行原代培養(yǎng)：37℃組：1/2，1，2，3，4h；4℃組1/2，1，2，3，4天，觀察細胞生長狀態(tài)。(3)檢測脂質(zhì)體、質(zhì)粒不同劑量下、脂質(zhì)體-質(zhì)粒復合物不同作用時間下、不同細胞傳代次數(shù)下EGFP轉(zhuǎn)染NSCs的轉(zhuǎn)染效率。

3、G418對陽性細胞篩選，觀察細胞生長情況。將篩選陽性的細胞進行傳代及誘導分化的觀察，免疫細胞化法鑒定。MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后NSCs的活力。(4)將篩選后的NSCs立體定向儀移植入大鼠側(cè)腦室，分別移植后4W，8W，12W，15w，行大鼠腦組織冰凍切片制作，熒光觀察。 結(jié)論：(1)從大鼠海馬中分離培養(yǎng)出具有自我更新和多分化潛能的細胞，該類細胞屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的NSCs，低溫下更易生長，是進行轉(zhuǎn)染的良好細胞模型；(2)脂質(zhì)體可較為高效