脂質(zhì)體介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討脂質(zhì)體介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞的最佳條件，轉(zhuǎn)染的NSCs移植入正常大鼠側(cè)腦室后，EGFP作為神經(jīng)干細(xì)胞示蹤劑的效果，為NSCs作為基因治療載體提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為轉(zhuǎn)染其它功能基因奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)從胎鼠、新生大鼠、成年大鼠海馬中分離NSCs，采用NSC克隆懸浮法，選用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，添加劑B27，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)及表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，

2、采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)NSC標(biāo)志物Nestin的表達(dá)及分化后細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和2，3-環(huán)核甘酸磷酸二脂酶(CNP)的表達(dá)。(2)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞離體后存活時(shí)間研究：在下列時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行原代培養(yǎng)：37℃組：1/2，1，2，3，4h；4℃組1/2，1，2，3，4天，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。(3)檢測(cè)脂質(zhì)體、質(zhì)粒不同劑量下、脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物不同作用時(shí)間下、不同細(xì)胞傳代次數(shù)下EGFP轉(zhuǎn)染NSCs的轉(zhuǎn)染效率。

3、G418對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞篩選，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。將篩選陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行傳代及誘導(dǎo)分化的觀察，免疫細(xì)胞化法鑒定。MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后NSCs的活力。(4)將篩選后的NSCs立體定向儀移植入大鼠側(cè)腦室，分別移植后4W，8W，12W，15w，行大鼠腦組織冰凍切片制作，熒光觀察。 結(jié)論：(1)從大鼠海馬中分離培養(yǎng)出具有自我更新和多分化潛能的細(xì)胞，該類細(xì)胞屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的NSCs，低溫下更易生長(zhǎng)，是進(jìn)行轉(zhuǎn)染的良好細(xì)胞模型；(2)脂質(zhì)體可較為高效