硫酸軟骨素化學發(fā)光法的快速測定及其ELISA雙抗體夾心法的建立.pdf

1、肺癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一,近十年來,肺癌的研究雖已取得了不少成績,但迄今為止肺癌對人類健康仍然有很大威脅.在我國肺癌發(fā)生率與病死率也有明顯升高的趨勢.據(jù)統(tǒng)計,約有70﹪的肺癌患者在發(fā)現(xiàn)時已屬中、晚期,失去了手術(shù)的最佳時機,如能早期發(fā)現(xiàn)可以使患者的5年生存率明顯提高.隨著生命科學研究的不斷發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)癌細胞能分泌一些活性物質(zhì),通過現(xiàn)代實驗技術(shù)手段能夠檢測出來,這些活性物質(zhì)被稱為腫瘤標志物.腫瘤標志物對腫瘤的早期發(fā)現(xiàn),檢測

2、腫瘤的發(fā)生生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、判斷療效及預后等方面均有重要的意義. 目前應(yīng)用較多的肺癌相關(guān)腫瘤標志物有神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、組織多肽抗原(TPA)、鱗狀細胞癌相關(guān)抗原(SCC-Ag)等,但由于靈敏度和特異性較低,臨床應(yīng)用受到制約.所以,長期以來,人們一直致力于尋找靈敏度和特異性都較高的肺癌腫瘤標志物,硫酸粘多糖是近些年來研究較多的一種肺癌腫瘤標志物.許多研究表

3、明硫酸粘多糖在非小細胞肺癌中有較高的陽性率(86.20﹪),而且特異性和敏感性都較高(特異性為96.55﹪,敏感性為86.20﹪),提示硫酸粘多糖可能是協(xié)助肺癌診斷的一個很好的標志物.硫酸粘多糖的正確命名是糖胺多糖(glycosaminoglycan,GAG),它是由糖醛酸與乙酰氨基糖或其硫酸酯組成的二糖單位形成的重復序列.哺乳動物的GAG包括硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate,CS)、硫酸皮膚素(Dermatan su

4、lfate,DS)、硫酸角質(zhì)素(Karatansulfate,KS)、肝素(Haparin,HP)、硫酸肝素或硫酸乙酰肝素(Haparan,HS)及透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)6種.研究發(fā)現(xiàn),硫酸粘多糖在肺癌早期即有升高,無論原發(fā)還是轉(zhuǎn)移性肺癌,癌組織中均有GAG含量增高,主要以透明質(zhì)酸(HA)和硫酸軟骨素(CS)的升高為主. 目前國內(nèi)外相關(guān)報道的檢測硫酸軟骨素的方法很多,如比色法、色譜法、電泳法、配位滴定法

5、、原子吸收法等.但這些方法都有其自身的局限性,主要是靈敏度低,本課題希望建立一種快速、靈敏、準確的檢測硫酸軟骨素的方法,為下一步建立檢測硫酸粘多糖的方法奠定基礎(chǔ).方法和結(jié)果: 1.采用Ced<'4+>-Na<,2>SO<,3>-H<,2>SO<,4>氧化還原體系,并利用該體系中加入硫酸軟骨素后發(fā)光強度明顯增強的特點,建立了一種快速測定硫酸軟骨素的化學發(fā)光分析方法.檢測結(jié)果如下:回歸方程為y=0.4219x+3.3532,r=0.

6、9968(其中y為樣品RLU與空白RLU的差值,x為CS濃度),線性范圍為1.Omg/L8.0m/L,檢出限為0/5mg/L.本部分初步建立了硫酸軟骨素的化學發(fā)光檢測方法,為以后的研究奠定基礎(chǔ). 2.為了制備多克隆抗體,用硫酸軟骨素作為免疫原分別免疫了4只BALB/c小鼠和2只日本大耳白兔.制備的抗血清分別用間接ELISA測效價和特異性,結(jié)果如下:4只BALB/cdJ、鼠抗血清終點效價分別為:1:6400,1:12800,1:6

7、400,1:3200,特異性良好;2只日本大耳白兔抗血清終點效價分別為1:64000,1:128000,且特異性良好. 3.通過優(yōu)化條件,初步建立了硫酸軟骨素的異種動物雙抗體夾心ELISA檢測方法.選取的檢測優(yōu)化條件為:包被抗體是1:200的2號鼠抗血清,封閉液是1﹪酪蛋白,第二抗體是1:20000的2號兔抗血清,辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgC(HRP-IgG)濃度是1:4000.檢測結(jié)果如下:回歸方程為y=0.2945x+0

8、.3968..r=0.9819(其中y為陽性孔OD值和陰性孔OD值之差,x為ln[CS]),線性范圍是2～800 mg/L,且該方法的特異性良好.高、中、低3個濃度的批內(nèi)和批間相對標準偏差的平均值分別為4.48﹪和5.97﹪. 4.用間苯三酚分光光度法檢測硫酸軟骨素標準品,結(jié)果如下:回歸方程為y=0.0011x-0.0106,(y是吸光度,x是CS的濃度),相關(guān)系數(shù)r=0.9918,線性范圍為200～800 mg/L.以間苯三酚

9、分光光度法為標準參比方法驗證異種動物雙抗體夾心ELISA方法的可靠性,檢測結(jié)果進行相關(guān)性和配對t檢驗分析,t=-0.247,P>0.05,r=0.999,P<0.01,表明2種方法相關(guān)性良好,ELISA檢測結(jié)果可靠.結(jié)論:1.建立了快速測定硫酸軟骨素的化學發(fā)光法,回歸方程為y=0.4219x+3.3532,r=0.9968(其中y為樣品RLU與空白RLU的差值,x為CS濃度),線性范圍為:1.0 mg/L～8.0 mg/L,方法的檢出限