腦積水動物蛛網(wǎng)膜絨毛內(nèi)皮細胞形態(tài)與功能改變的實驗研究.pdf

1、背景和目的腦積水是神經(jīng)外科多發(fā)疾病，盡管腦脊液分流手術和三腦室造瘺的手術廣為開展，但總體治療效果仍然不佳。以美國2000年的橫斷面調(diào)查為例，全年5574例接受分流手術的病人中，40.7％的病人是因為原來的分流障礙而需要進行再次手術。要解決腦積水的問題，需要研究腦脊液的分泌、循環(huán)、吸收三個環(huán)節(jié)。這三個環(huán)節(jié)彼此有何相互影響?例如，在腦脊液循環(huán)過程中某處造成梗阻，是否會對腦脊液的吸收功能造成繼發(fā)改變?基于這種思路，本研究擬在構建成年犬腦積水動

2、物模型的基礎上，首先研究蛛網(wǎng)膜絨毛的顯微結構，以及腦積水狀態(tài)下上矢狀竇周圍的蛛網(wǎng)膜絨毛形態(tài)改變，CD31和vonWillebrand因子的特異性表達變化，了解腦積水以后蛛網(wǎng)膜絨毛內(nèi)皮細胞的形態(tài)有無變化。然后通過蛛網(wǎng)膜下腔注射同位素示蹤劑的方法，了解蛛網(wǎng)膜絨毛對腦脊液的吸收功能在不同時段的的變化。以期對于腦積水狀況下的蛛網(wǎng)膜顆粒繼發(fā)的病理生理改變和功能變化做出說明，并為下一步研究和腦積水的治療方案的選擇提供思路。 材料與方法

3、 本實驗第一部分重點觀察腦積水后的內(nèi)皮細胞形態(tài)學改變。采用26只雜種犬作為實驗動物。2只用于蛛網(wǎng)膜顆粒的HE染色研究，另外24支動物隨機分為4組，第1組為假手術對照組，枕大池中注射生理鹽水。第2、3、4組為腦積水組(急性期組、亞急性期組和慢性期組)，手術做犬寰枕部直切口，切開寰枕筋膜，根據(jù)0.3ml/kg的劑量在枕大池-第四腦室內(nèi)注入Fluid200型硅油(10,000c.s.)。術后對實驗犬進行行為學觀察和Tarlov神經(jīng)功能評分。

4、第2、3、4組動物分別在手術后3天、2周、12周處死，處死前經(jīng)磁共振頭顱掃描驗證腦積水的發(fā)展情況并精確測量腦室相關徑線，進行各組間對比。2只HE染色組動物經(jīng)雙側頸動脈灌注4％甲醛后取材，石蠟包埋，從前到后軸位間隔0.5mm連續(xù)切片，每張切片厚0.6μm，在光鏡下觀察采集圖片。在各組動物中各取一只，經(jīng)雙側頸動脈灌注2％的戊二醛后取材，經(jīng)固定、修塊后進行50nm的超薄切片，電子顯微鏡下觀察、照相。各組動物中各取5只，經(jīng)雙側頸動脈灌注Zamb

5、oni液(含2％多聚甲醛，15％苦味酸的0.1mol/L磷酸緩沖液，pH值7.4)后取材，做冰凍切片后分別進行CD-31，vonWillebrand因子的免疫熒光組織化學染色，并對蛛網(wǎng)膜絨毛表面內(nèi)皮細胞的表達情況進行統(tǒng)計學分析。 本實驗的第二部分測量腦積水后蛛網(wǎng)膜絨毛吸收功能的改變。將20只成年雜種犬隨機分成4組。實驗組(第2、3、4組)仍按第一部分方法構建腦積水模型，假手術對照組為第1組。假手術對照組在手術后1周，急性期組在手

6、術后3天，亞急性期組在手術后2周，慢性期組在手術后12周分別行阻塞篩板的手術，然后在顱內(nèi)蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)注射1ml含有50μCi3H2O的生理鹽水。注射后解剖頸總靜脈，分別在注射后1小時、4小時、8小時、16小時、48小時采血。血樣經(jīng)血清析出并處理后，用液體閃爍計數(shù)儀測量放射性同位素含量。根據(jù)上述結果繪制各組的平均吸收曲線。另外，繪制每只動物的吸收曲線后，計算1-48小時內(nèi)的曲線下面積(AUC)，作為該動物經(jīng)蛛網(wǎng)膜絨毛吸收腦脊液能力的參考。

7、各組動物AUC值采用方差分析進行比較。 結果 (1)通過在犬枕大池-四腦室內(nèi)注射硅油的方法，我們成功的構建了腦積水動物模型，實驗犬在手術后急性期(1～3天內(nèi))表現(xiàn)出反應遲鈍，對外界刺激表現(xiàn)淡漠，少食或拒食拒飲，嗜睡等癥狀。術后各組Tarlov評分結果提示正常對照組與腦積水組(第2、3、4組)評分結果有顯著性差異。 (2)術后分時段頭顱磁共振結果顯示各腦積水組動物腦室隨時間而表現(xiàn)出進行性擴大的趨勢。在慢性期，腦室極

8、度擴大，大腦皮質(zhì)萎縮。(3)犬蛛網(wǎng)膜絨毛主要分布于上矢狀竇中份偏前的位置，與中央靜脈回流至上矢狀竇的位置吻合。 (4)犬蛛網(wǎng)膜絨毛HE染色的結果發(fā)現(xiàn)：犬蛛網(wǎng)膜絨毛具有最外層的內(nèi)皮細胞層，其下的纖維囊，蛛網(wǎng)膜細胞層(杯細胞叢)，以及中央核。有的絨毛呈球形，有的則以分葉狀或是匍匐式生長，形態(tài)極不規(guī)則。還有一些則是表面的纖維囊極不發(fā)達，幾乎是蛛網(wǎng)膜細胞層緊貼著內(nèi)皮細胞層。 (5)使用anti-CD31免疫熒光組織化學染色的結果

9、顯示：在整個靜脈竇內(nèi)皮細胞上，都顯示陽性。包括蛛網(wǎng)膜絨毛表面的內(nèi)皮細胞，其顯色強度與竇內(nèi)皮細胞無異。方差分析的結果顯示四組動物之間蛛網(wǎng)膜絨毛內(nèi)皮細胞CD31表達差異無顯著性。 (6)vonWillebrand因子的免疫熒光組織化學染色則表明：在正常3犬對照組，蛛網(wǎng)膜絨毛頂端內(nèi)皮細胞的vonWillebrand因子的表達較竇壁內(nèi)皮細胞明顯減弱。各組間方差分析的結果顯示各組動物蛛網(wǎng)膜絨毛表面內(nèi)皮細胞vonWillebrand因子表達

10、差異有顯著性，亞急性期與慢性期腦積水蛛網(wǎng)膜絨毛表面內(nèi)皮細胞vonWillebrand因子表達較正常組和急性期組增強。 (7)第二部分的功能實驗發(fā)現(xiàn)：注射入犬蛛網(wǎng)膜下腔的氚水的吸收呈現(xiàn)出偏態(tài)分布的單峰曲線的特征。在正常組與急性期組以及亞急性期組，靜脈血中的氚水含量在8小時的時候達到高峰，隨后緩慢下降。慢性期組動物的靜脈血液中氚水的含量在16小時時達到高峰，峰值較正常對照組顯著降低。對各組動物吸收曲線下面積(AUC)進行方差分析后發(fā)

11、現(xiàn)，①正常對照組、急性期組和亞急性期組三組彼此之間，無顯著性差異；②在正常對照組與慢性期組間，數(shù)據(jù)存在顯著性差異；③在急性期組和慢性期組間，數(shù)據(jù)存在顯著差異；④在亞急性期組和慢性期組之間，數(shù)據(jù)存在顯著差異。慢性期組AUC值明顯下降。 結論 (1)犬蛛網(wǎng)膜絨毛與人蛛網(wǎng)膜顆粒具有基本相同的層次結構(同樣具有內(nèi)皮細胞層、纖維囊、蛛網(wǎng)膜細胞層和中央核)。實驗犬蛛網(wǎng)膜絨毛主要位于上矢狀竇中份偏前的部分，與中央靜脈回流至上矢狀竇的位

12、置基本吻合。 (2)電鏡研究的結果顯示犬蛛網(wǎng)膜絨毛內(nèi)皮細胞內(nèi)的質(zhì)膜小泡在腦積水狀態(tài)下減少。 (3)犬蛛網(wǎng)膜絨毛表面完整地覆蓋了內(nèi)皮細胞。其CD31免疫熒光染色在腦積水時無變化。絨毛表面的內(nèi)皮細胞vonWillebrand因子表達較竇壁內(nèi)皮細胞減弱，但是在腦積水慢性期，絨毛內(nèi)皮細胞vonWillebrand因子表達發(fā)生了改變，提示了此時絨毛內(nèi)皮細胞結構和功能可能發(fā)生了變化。 (4)在阻塞篩板，排除主要的頭頸淋巴引流