miR29C-TGFβ1-Smad3在實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦積水相互作用的機制研究.pdf

1、慢性腦積水是蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)后的常見并發(fā)癥，但具體機制不清，動物實驗及臨床檢查顯示出血后腦積水與轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-beta1，TGF-β1)過度表達導致的柔腦膜纖維化、蛛網(wǎng)膜下腔細胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)沉積有關。柔腦膜是蛛網(wǎng)膜和軟腦膜的合稱，二者在胚胎發(fā)育和組織分化上關系密切且均起源于神經(jīng)

2、管周圍的間充質(zhì)。蛛網(wǎng)膜下腔為蛛網(wǎng)膜與軟腦膜之間的空隙，其間有大量纖維小梁貫穿。膠原纖維為柔腦膜中最主要的成分，柔腦膜細胞間形成大量橋粒和緊密連接，構(gòu)成防止腦脊液通透的屏障。由于離體條件下柔腦膜來源的細胞在形態(tài)學及細胞表面蛋白表達方面的差異性，且柔腦膜細胞具有一定的干細胞特性，因此目前認為柔腦膜細胞是腦內(nèi)特殊的成纖維細胞。合成膠原的主要細胞可能是柔腦膜細胞，SAH后蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)柔腦膜細胞大量增生是纖維化的重要因素，膠原的主要來源可能與腦脊

3、液中炎癥因子的刺激密切相關。細胞外基質(zhì)(extracellular matrix ECM)的主要成分為膠原蛋白，包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型膠原等，ECM的合成與降解失衡是組織器官纖維化的基礎。Ⅰ型前膠原合成Ⅰ型膠原時由蛋白酶水解下來的羧基端肽稱為Ⅰ型膠原羧基端肽(procollagenⅠC-Terminal propeptide PⅠCP)，Ⅲ型前膠原分泌到細胞外后被蛋白酶切下的N端肽稱為Ⅲ型膠原氨基端肽(PⅢNP)，它們可作為膠原合成

4、以及纖維化的間接指標。目前認為，蛛網(wǎng)膜下腔出血后膠原合成包括Ⅰ型和Ⅲ型，以Ⅰ型膠原產(chǎn)生為主，柔腦膜細胞中的Ⅰ型膠原蛋白、腦脊液中的PⅠCP可作為反應柔腦膜及蛛網(wǎng)膜下腔纖維化的指標。Masson染色可以顯示柔腦膜膠原纖維的厚度，可以作為柔腦膜纖維化的檢測方法。
　　首先通過建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，檢測出血后不同時間柔腦膜細胞中miR-29a/b/c表達變化，確定miR-29c在出血后表達下降，選擇miR-29c為研究目標。然后新

5、建大鼠SAH模型，檢測大鼠SAH后TGF-β1表達升高，miR-29c表達降低，通過慢性毒載體LV-rno-miRNA-29c成功過表達miR-29c。對比檢測腦脊液中PⅠCP含量，表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦脊液中PⅠCP含量隨柔腦膜纖維化升高，維持miR-29c過表達可下調(diào)蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦脊液中PⅠCP含量。通過柔腦膜Masson染色，說明維持miR-29c過表達后柔腦膜內(nèi)膠原合成顯著降低，大鼠頭部MRI檢測顯示，對比大鼠過表達miR-

6、29c可以降低大鼠腦積水形成的比率幾率，減少腦積水的形成。體外培養(yǎng)大鼠柔腦膜細胞，培養(yǎng)液中加用外源性TGF-β1，通過小干擾RNA技術(short interfering RNA，siRNA)，選擇脂質(zhì)體Lipofectamine(@)2000作為載體，并且通過轉(zhuǎn)染后Smad3抑制表達的對比，篩選samd3-rat-493作為轉(zhuǎn)染目標。成功抑制Smad3表達后，檢測到miR-29c表達升高，柔腦膜細胞中Ⅰ型膠原蛋白含量降低。
　　

7、綜上所述，miR-29c高表達可以抑制柔腦膜纖維化，減少實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦積水的形成，并且可以通過TGF-β1/Smad3信號系統(tǒng)參與柔腦膜纖維化，抑制Smad3的表達上調(diào)miR-29c并抑制柔腦膜細胞纖維化。miR-29c將是治療或預防蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦積水可能的靶目標。
　　本文主要從以下幾方面進行了論述:
　　第一部分 miRNA-29c在實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦積水形成中的作用研究
　　目的:研究miRN

8、A-29c在實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦積水形成中的作用。
　　方法:建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，檢測miRNA-29a/b/c在不同時間點的變化，選擇miRNA-29c作為我們研究對象。建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，并通過建立miR-29c慢病毒過表達載體過表達miR-29c，檢測腦脊液中PⅠCP含量變化及柔腦膜厚度改變，以及其對腦積水形成的影響。
　　1.選擇研究目標:通過立體定向儀，建立10只大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，10只空

9、白對照組大鼠。分別于建模前、建模后3天、7天、10天、14天，檢測腦膜miRNA-29a、b、c變化。確定選擇miRNA-29c作為研究對象。
　　2.miRNA-29c在蛛網(wǎng)膜下腔出血中的作用:
　　2.1選取48只大白鼠，隨機數(shù)字表法分為假手術組（16只）、空白慢病毒組（16只）和實驗組（16只，LV-rno-miRNA-29c組）。全部3組行大鼠頭部MRI。建立miR-29c慢病毒過表達載體LV-rno-miRNA-2

10、9c，并通過立體定向儀將入5μL生理鹽水、空白慢病毒、實驗組（LV-rno-miRNA-29c組）分別植入假手術組、空白病毒對照組、實驗組大鼠。1周后實驗組、空白病毒組采用枕大池二次注血法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，假手術組枕大池注入等量生理鹽水。
　　2.2.3周后假手術組、空白病毒對照組和實驗組行頭部MRI檢查，對比各組大鼠腦室系統(tǒng)變化。
　　2.3.3周后通過PCR檢測腦脊液TGF-β1、miR-29c含量。ELLISA方

11、法檢測腦脊液實PⅠCP含量變化，Masson染色檢實驗組大鼠柔腦膜厚度。
　　結(jié)果:
　　1.選擇研究目標:SAH后3、7、10、14天大鼠腦膜miR-29a含量升高，miR-29b含量不穩(wěn)定，miR-29c含量降低。我們選擇miR-29c作為研究目標。
　　2.miR-29c在SAH后腦積水中的作用
　　2.1.假手術組、空白病毒對照組和實驗組分別檢測ELLISA方法檢測腦脊液PⅠCP，顯示實驗組（過表達miR

12、-29c）表達增加。
　　2.2.Realtime PCR檢測各組柔腦膜細胞TGF-β1、miR-29c的表達，實驗組（過表達miR-29c）柔腦膜細胞中miR-29c含量增加，且實驗組及空白病毒對照組TGF-β1含量較假手術組增加。
　　2.3.磁共振檢查顯示顯示實驗組（過表達miR-29c）較空白病毒組腦室擴大的比例減少，假手術組未出現(xiàn)。
　　結(jié)論:蛛網(wǎng)膜下腔出血可以導致miR-29c下降，且過表達miR-29c可

13、以抑制柔腦膜纖維化，并減少慢性腦積水的形成。
　　第二部分 miR29c-TGFβ1/Smad3在柔腦膜纖維化的作用研究
　　目的:研究miR-29c與TGFβ1/Smad3信號系統(tǒng)在柔腦膜纖維化中的作用。
　　方法:體外培養(yǎng)大鼠原代柔腦膜細胞，培養(yǎng)液中加用TGF-β1，并通過小干擾RNA技術，利用脂質(zhì)體2000(Lipo2000)轉(zhuǎn)染smad3-siRNA，抑制Smad3表達，對比檢測miR-29c、柔腦膜纖維蛋白原

14、Ⅰ型的改變。建立三個實驗組:實驗組（5ng/ml TGF-β1+smad3-siRNA組）、內(nèi)對照組（5ng/ml TGF-β1+control-siRNA組）、空白對照組(0ng/ml TGF-β1+control-siRNA組)，各組siRNA預處理24小時后，給予TGF-β1刺激48小時。行RT-PCR檢測miR-29c，WESTERN檢測smad3、Ⅰ型膠原蛋白。
　　1.購買大鼠原代柔腦膜細胞，通過細胞凍存及復蘇體外培養(yǎng)

15、原代大鼠柔腦膜細胞。應用小干擾RNA技術，建立脂質(zhì)體2000(Lipo2000)轉(zhuǎn)染smad3-siRNA，加入培養(yǎng)液中抑制，siRNA預處理24小時后，給予TGF-β1刺激48小時。
　　2.行RT-PCR檢測miR-29c，WESTERN檢測smad3、Ⅰ型膠原蛋白。
　　結(jié)果:1.成功建立smad3-siRNA并轉(zhuǎn)染腦膜細胞，WESTERN檢測smad3較其他兩組下降，證實實驗組siRAN-Smad3可以抑制smad3