小鼠腎發(fā)生發(fā)育中BCL-2-BAX的表達(dá).pdf

1、前言
　　 器官的發(fā)生無一例外具有細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡兩種行為,并發(fā)生在胚胎發(fā)育過程中的特定部位和時間,有著嚴(yán)格的時空順序。細(xì)胞增殖是組織和器官發(fā)育的基礎(chǔ),而細(xì)胞凋亡則賦予了組織結(jié)構(gòu)發(fā)育的可塑性[1-4]。近幾年的研究表明,細(xì)胞凋亡既是胚胎正常發(fā)育中的重要事件,又是致畸因素導(dǎo)致胚胎異常發(fā)育的重要形式[5-6]。
　　 哺乳動物腎臟的發(fā)生和發(fā)育是一個復(fù)雜而又連續(xù)的過程,經(jīng)歷了前腎、中腎和后腎三個階段,最后由后腎發(fā)育為成熟腎臟

2、。后腎由輸尿管芽和生后腎組織相互誘導(dǎo)形成。前者分化、發(fā)育為各級集合管,后者經(jīng)過細(xì)胞凝聚,管狀細(xì)胞集合以及間質(zhì)-上皮的轉(zhuǎn)分化發(fā)育為腎單位,兩者構(gòu)成腎實(shí)質(zhì)[7-8]。
　　 腎臟發(fā)育中一個引人注目的事件就是必須經(jīng)歷生長與退化同在、增殖與凋亡并存的矛盾統(tǒng)一過程。其不同發(fā)育階段的差異與增殖和凋亡之間的動態(tài)變化直接相關(guān)。在前腎、中腎和后腎的發(fā)育過程中,都有細(xì)胞凋亡的參與[9-10]。例如后腎的發(fā)生是建立在輸尿管芽與生后腎原基相互誘導(dǎo)的基礎(chǔ)

3、上,其中被輸尿管芽誘導(dǎo)的間質(zhì)細(xì)胞分化生成腎實(shí)質(zhì),而未能被輸尿管芽誘導(dǎo)的間質(zhì)細(xì)胞則發(fā)生凋亡。此外,腎小管由最初的“S”形小管演變成各個節(jié)段腎小管的過程中都有凋亡的參與。同樣,在腎臟疾病的轉(zhuǎn)歸過程中也有細(xì)胞凋亡的參與[11-13],通過細(xì)胞凋亡有效的清除了過多的,受損的腎細(xì)胞或浸潤的炎細(xì)胞[14-15],但毫無控制的細(xì)胞凋亡造成的腎組織細(xì)胞的丟失或凋亡不足則引起腎臟的病理改變,前者可以引起慢性腎衰竭后期腎纖維化、腎萎縮等現(xiàn)象,后者將導(dǎo)致某些

4、情況下多細(xì)胞狀態(tài)的持續(xù)存在及一系列后續(xù)結(jié)果[16-18]。
　　 凋亡相關(guān)蛋白BCL-2家族是細(xì)胞凋亡通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器,由抗凋亡蛋白(如:BCL-2)和促凋亡蛋白(如:BAX)組成[19-21]。BCL-2蛋白主要分布在線粒體外膜的胞漿面,具有穩(wěn)定線粒體膜的功能,通過抑制線粒體膜電位的降低、抑制細(xì)胞色素C(Cytc)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的釋放及抑制半胱天冬酶(caspase)的激活而抑制凋亡[22-25]。凋亡相關(guān)蛋白BAX

5、正好相反,BAX主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,凋亡誘導(dǎo)信號可以使BAX的構(gòu)象改變,并整合于線粒體的外膜,最終導(dǎo)致線粒體通透轉(zhuǎn)換孔打開,Cytc和AIF釋放,引起細(xì)胞凋亡[21,26-29]。因此,BCL-2家族抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比率直接決定了線粒體外膜各種通道的開放程度,形成了細(xì)胞凋亡調(diào)控的樞紐。
　　 腎臟的細(xì)胞凋亡受到外因和內(nèi)因的調(diào)控,生長因子是重要的外源性調(diào)節(jié)因素,而BCL-2家族蛋白則是關(guān)鍵的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因素[22]。在胚胎腎

6、的發(fā)育中,一旦生后腎原基被輸尿管芽誘導(dǎo),其BCL-2水平即明顯上調(diào),使間充質(zhì)細(xì)胞成功向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化[30-31],而BCL-2的丟失或許影響著腎臟分化/成熟的能力[32]。BCL-2敲除的動物模型其生后腎原基的間充質(zhì)細(xì)胞將發(fā)生惡性凋亡,出生時即表現(xiàn)為腎發(fā)育不全,之后則發(fā)育為多囊腎[30-31,33]。
　　 腎臟在實(shí)現(xiàn)其生理功能從低級到高級的長期進(jìn)化中形成了空間排列精致的微細(xì)結(jié)構(gòu),其與功能相輔相成是實(shí)現(xiàn)腎重要生理功能的保證。在皮

7、髓質(zhì)中兩種。腎小管存在著種屬差異,這種結(jié)構(gòu)的差異,決定了對腎小球?yàn)V過液的重吸收,以及尿液濃縮與稀釋等重要腎生理功能的種屬差異[34-37]。因此,在探索腎生理及病理現(xiàn)象時,即需要平面結(jié)構(gòu)和立體結(jié)構(gòu)相結(jié)合的分析,又需要結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)聯(lián)的思維。
　　 上世紀(jì)80年代之前,組織微細(xì)結(jié)構(gòu)的三維研究主要采用對連續(xù)二維顯微圖像的描述。這種傳統(tǒng)的組織形態(tài)學(xué)研究方法工作量繁重又耗時,常常限制了連續(xù)切片的數(shù)量,微細(xì)結(jié)構(gòu)包含的三維形態(tài)信息也必然有限

8、。在大存儲量,高運(yùn)算速度的計算機(jī),先進(jìn)顯微鏡配上高分辨率的CCD數(shù)碼相機(jī)的配合下,對組織微細(xì)結(jié)構(gòu)的三維研究已經(jīng)發(fā)展到數(shù)字手段。
　　 本研究采用數(shù)字手段三維重建腎微細(xì)結(jié)構(gòu),使小鼠腎發(fā)育中小管精確走行的描述得以實(shí)現(xiàn),并在此基礎(chǔ)上對特定時間的腎組織切片采用免疫組化與計算機(jī)三維重建相結(jié)合的技術(shù),精確的顯示凋亡相關(guān)蛋白BCL-2和BAX的表達(dá)部位,以及凋亡細(xì)胞的分布,并探討其對腎臟發(fā)育的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 采用

9、適當(dāng)濃度的強(qiáng)堿溶液蝕刻環(huán)氧樹脂以提高免疫反應(yīng),并應(yīng)用高溫高壓以提高其抗原性,隨后檢測小鼠腎臟發(fā)育過程中增殖與凋亡相關(guān)蛋白在樹脂切片上的表達(dá)。經(jīng)心臟灌流固定后取E17d和P7d小鼠腎組織塊,并樹脂812包埋,垂直腎長軸從腎被膜到腎外髓外帶2.5μm連續(xù)半薄切片,顯微鏡下獲取數(shù)字圖像,計算機(jī)配準(zhǔn),C語言編程,選取連續(xù)切片,樹脂切片倒扣再包埋,1μm連續(xù)切片,對組織進(jìn)行BCL-2及BAX免疫組化染色,追蹤陽性反應(yīng)腎小管并三維重建目的小管的走行

10、。最后應(yīng)用免疫組化、原位末端標(biāo)記技術(shù)并結(jié)合體視學(xué)分析方法觀察E16d、E18d和P1d、P3d、P5d、P7d、P14d、P21d小鼠腎臟不同發(fā)育時期BCL-2、BAX及細(xì)胞凋亡的演變規(guī)律。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、樹脂與石蠟切片上增殖與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及原位末端標(biāo)記法對凋亡細(xì)胞的檢測
　　 凋亡相關(guān)蛋白BCL-2和BAX在樹脂切片與石蠟切片的表達(dá)一致,但樹脂切片的組織結(jié)構(gòu)比石蠟切片更完整。增殖相關(guān)蛋白K16

11、7的陽性表達(dá)只出現(xiàn)在石蠟切片上,在樹脂切片上則沒有表達(dá)。
　　 TUNEL陽性細(xì)胞在樹脂切片與石蠟切片的表達(dá)一致,而且,樹脂切片比石蠟切片展示了更為良好的組織結(jié)構(gòu)。
　　 2、樹脂切片上BCL-2和BAX的免疫熒光雙標(biāo)
　　 在樹脂切片上也可以顯示凋亡相關(guān)蛋白BCL-2和BAX的免疫熒光雙標(biāo)染色。通過免疫熒光雙標(biāo)染色可見,P14d時,BCL-2和BAX的表達(dá)位于皮質(zhì)全層的小管內(nèi),部分小管細(xì)胞BCL-2(綠色熒光)

12、和BAX(紅色熒光)表達(dá)重疊呈黃色,部分小管細(xì)胞只有BCL-2表達(dá)。
　　 3、倒扣再包埋切片上BCL-2和BAX陽性表達(dá)小管的三維追蹤
　　 通過追蹤顯示,E17d和P7dBCL-2和BAX的陽性表達(dá)主要位于深層腎皮質(zhì)區(qū)的近端小管。陽性反應(yīng)強(qiáng)的腎小管均為成熟的近端小管,發(fā)育中近端小管的表達(dá)為弱陽性。遠(yuǎn)端小管幾乎不表達(dá),如有也呈弱陽性。生腎區(qū)各結(jié)構(gòu)及腎小體無表達(dá),髓質(zhì)到乳頭區(qū)小管橫斷面上也有微弱表達(dá)。陽性強(qiáng)度為+++的腎

13、小管均為長髓袢腎單位的腎小管,陽性強(qiáng)度為++的腎小管均為短髓袢腎單位的腎小管。
　　 4、小鼠腎臟不同發(fā)育階段BCL-2及BAX的表達(dá)
　　 在腎臟的發(fā)育過程中,BCL-2及BAX主要表達(dá)于成熟近端小管上皮細(xì)胞,發(fā)育中的近端小管和遠(yuǎn)端小管表達(dá)較弱,生腎區(qū)各結(jié)構(gòu)及腎小體無BCL-2及BAX的表達(dá)。從P1d～P21d,BCL-2和BAX的表達(dá)由皮質(zhì)的近髓質(zhì)區(qū)逐漸發(fā)展到中層皮質(zhì)區(qū)最后擴(kuò)展到整個腎皮質(zhì)區(qū)。其中,皮質(zhì)迷路中的近端小

14、管(近曲小管)表達(dá)較強(qiáng),髓放線和外髓外帶中的近端小管(近直小管)表達(dá)微弱,遠(yuǎn)端小管表達(dá)較弱,髓質(zhì)的其他部分未見表達(dá)。
　　 免疫熒光顯示,部分小管細(xì)胞BCL-2和BAX的表達(dá)重疊,部分小管細(xì)胞只有BCL-2的表達(dá)。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征,共表達(dá)的部位均為成熟的近端小管曲部細(xì)胞,而只有BCL-2表達(dá)的細(xì)胞的形態(tài)特征與未成熟近端小管或遠(yuǎn)端小管細(xì)胞形態(tài)相似。
　　 5、小鼠腎臟不同發(fā)育階段BCL-2/BAX數(shù)量的變化
　　

15、BCL-2陽性表達(dá)腎小管的面數(shù)密度(NA)從E18d到P1d增長速度最快,P7d之后變化不大;BAX陽性表達(dá)腎小管的NA從E16d到P3d逐漸升高,隨后短暫下降,在P7d又開始逐漸升高;BCL-2/BAX比值從P3d開始升高,在P7d時達(dá)到頂峰,隨后降低。
　　 6、小鼠腎臟不同發(fā)育階段TUNEL陽性細(xì)胞的表達(dá)
　　 在腎臟的發(fā)育過程中,生腎區(qū)的各個結(jié)構(gòu)均有少量TUNEL陽性細(xì)胞,皮質(zhì)區(qū)腎小體、腎小管和間充質(zhì)細(xì)胞以及腎髓

16、質(zhì)乳頭區(qū)小管的凋亡細(xì)胞多見。隨著發(fā)育的不斷進(jìn)行,生腎區(qū)的凋亡細(xì)胞以基質(zhì)細(xì)胞為主,皮質(zhì)區(qū)的凋亡細(xì)胞則以腎小管細(xì)胞為主,間充質(zhì)細(xì)胞陽性表達(dá)較普遍,腎乳頭區(qū)的大量凋亡細(xì)胞在發(fā)育的后期減少。
　　 7、小鼠腎臟不同發(fā)育階段凋亡指數(shù)的變化
　　 腎小體的凋亡指數(shù)(AI)在P14d達(dá)到高峰,隨后顯著下降,而腎小管的AI在P7d之后變化不大。腎乳頭區(qū)的AI明顯大于腎小管和腎小體的AI,但從P14d～P21d則大幅降低。
　　

17、結(jié)論
　　 1、樹脂切片上的免疫組化既可以特異性的顯示蛋白的定位表達(dá)也展示了保存良好的組織結(jié)構(gòu),為結(jié)構(gòu)的三維重建和追蹤打下基礎(chǔ)。計算機(jī)輔助的腎微細(xì)結(jié)構(gòu)三維重建,為小鼠腎發(fā)育過程中腎小管空間走行的研究提供了一個更為有效的平臺。
　　 2、在腎臟的發(fā)育過程中,BCL-2和BAX的表達(dá)與近端小管的發(fā)育密切相關(guān)。與凋亡的發(fā)生并不存在直接關(guān)系。BCL-2和BAX的表達(dá)是腎發(fā)育過程中近端小管上皮細(xì)胞生長或上皮損傷后修復(fù)能力的體現(xiàn),與