不同劑量白藜蘆醇對高脂模型小鼠脂代謝及相關基因SIRT1，LXR-α和ABCA1影響的實驗研究.pdf

1、近年來,心腦血管疾病已成為嚴重威脅我國居民健康的重大疾病。引起心腦血管疾病的病因目前尚不完全清楚,但血脂異常是導致心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要危險因素已經得到了多數研究的支持。因此探討脂代謝機制對預防心腦血管疾病有著積極的應用及科學意義。流行病學調查發(fā)現(xiàn)高脂飲食的法國人卻伴隨著較低的心腦血管發(fā)病率,這與飲用紅葡萄酒有關。白藜蘆醇(Resveratrol,RSV)是廣泛存在于葡萄、花生和多種植物中的一種多酚類化合物,已在72種植物中被發(fā)現(xiàn),

2、以中藥虎杖中含量最高。研究表明,RSV具有降低血脂、抗血小板聚集、誘導腫瘤細胞凋亡、提高免疫功能等生理活性,已成為人們研究的熱點。多數文獻認為RSV能夠提高SIRT1酶活性并提高乙酰化底物的親和力,是SIRT1的功能激活劑。
　　 沉默信息調節(jié)因子(Silent information regulator 1,SIRT1)是哺乳動物中與SIR2(Silent information regulator 2,SIR2)同源的基因,

3、SIR2是一類首先在酵母菌中發(fā)現(xiàn)的通過染色體沉默機制和細胞能量代謝機制調節(jié)細胞壽命的重要基因。SIRT1編碼的核蛋白通過去乙?；饔脜⑴c多種新陳代謝活動,通過多種組蛋白和非組蛋白來完成不同的功能,其中肝X受體(Liver X receptors,LXRs)是與膽固醇,甘油三酯和糖代謝密切相關的一類具有基因調控作用的核受體。膽固醇的一些代謝產物如羥基固醇24s,25-環(huán)氧膽固醇等是其內源的激活配體。鑒于SIRT1對于LXRs的調節(jié)作用,如

4、果能夠通過調節(jié)SIRT1活性間接調節(jié)LXRs的表達,則可以對脂代謝起到良好的調節(jié)效果。SIRT1通過LXRs影響膽固醇代謝的具體機制研究國內尚未見到相關報道。
　　 本研究采用不同劑量的白藜蘆醇對高脂模型小鼠進行干預,觀察其血脂和氧化應激水平的變化,并研究SIRT1,LXR-α和ABCA1基因在mRNA水平的表達情況,以探討RSV是否能夠提高SIRT1的活性,并間接調節(jié)LXRs及其下游靶基因的表達。
　　 材料與方法：<

5、br>　　 一、實驗動物與分組
　　 50只8w齡健康雄性昆明種小鼠,適應性飼養(yǎng)1w后,根據體重隨機抽取10只作為基礎組,繼續(xù)給予基礎飼料喂養(yǎng)；其余40只給予高脂高膽固醇飼料(總脂肪含量為10％,膽固醇含量為1％),4w后,禁食12h,由其內眥靜脈采血0.5ml左右,離心分離血清,測定總膽固醇(Total cholesterol,TC)水平,其中高脂飼料組按TC水平,隨機分為4組:高脂組,白藜蘆醇低5meal(kg·bw·d)

6、、中22.5mg/(kg·bw·d)、高45mg/(kg·bw·d)劑量組。此后進行干預,基礎組和高脂組均灌胃羧甲基纖維素(Carboxymethyl cellulose solution,CMC)0.5％溶液,白藜蘆醇低、中、高劑量組分別給予不同劑量的白藜蘆醇羧甲基纖維素溶液。干預期間,小鼠自由攝食飲水,每周稱2次體重,根據體重調整灌胃劑量,干預時間為8w。
　　 二、測定指標及方法
　　 (一)血脂
　　 在

7、干預期末,各組取10 只小鼠禁食12h后,乙醚麻醉下,摘眼球取血,離心分離血清,按照試劑盒說明測量下列指標:TC、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)。
　　 (二)氧化應激指標
　　 取保存血清和適量肝

8、組織,勻漿,測量氧化應激指標；按照試劑盒說明測量下列指標:總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)。
　　 (三)肝臟病理學觀察
　　 大體觀察 分離肝臟,觀察其形態(tài)、顏色和質地變化；

9、計算肝指數:肝指數(％)=肝重(g)/體重(g)×100。HE切片鏡下觀察。
　　 (四)小鼠肝臟SIRT1、LXR-α和ABCA1 mRNA的表達量
　　 用Trizol試劑提取肝組織中的總RNA,將其溶于Erasol水中,紫外分光光度計測定此RNA溶液的A2260/A280比值。用RT-PCR試劑盒逆轉錄并擴增各組小鼠肝臟中SIRT1 mRNA、LXR-αmRNA和ABCA1 mRNA。PCR產物經2％瓊脂糖凝膠電泳

10、,并與Marker比較之后,在電泳凝膠成像分析儀上凝膠成像,用Scion Image4.03軟件進行灰度分析,以灰度值表示電泳帶強弱,以與內對照β-actin的比值作為目的基因表達的相對含量。
　　 三、數據處理
　　 用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數據分析,實驗結果用(x)±s表示,用方差分析比較各組間統(tǒng)計學差異,組間兩兩比較用LSD法。檢驗水準:α=0.05。
　　 結果
　　 一、動物一般狀況及體重

11、變化
　　 實驗期間,各組小鼠一般狀況良好,生長發(fā)育未見異常表現(xiàn)。各組小鼠干預前后,RSV低劑量組增重最多,但各組間比較無明顯差異(P>0.05)。
　　 二、肝臟病理變化
　　 比較各組肝指數值,可得高脂組高于其他組(P<0.05)。觀察肝臟大體可見基礎組小鼠肝臟形態(tài)、質地、顏色均正常；高脂組的肝臟體積增大,外形飽滿圓鈍,色澤灰黃,切面油膩,質地較脆；而RSV各組小鼠肝臟體積略增大,邊緣稍鈍,暗紅色,接近基礎組

12、。
　　 觀察病理切片可見:基礎組小鼠肝細胞形態(tài)正常,無脂肪變性,細胞排列緊密。高脂組小鼠的肝臟中有少數肝細胞發(fā)生了脂肪變,但尚未達到脂肪肝的程度。不同劑量的RSV組小鼠均有少數肝細胞發(fā)生了脂肪變,其中中劑量組肝細胞脂肪變性較少,細胞排列較緊密。
　　 三、血脂水平
　　 在血清TC水平上,高脂組明顯高于基礎組(P<0.05)；各組血清LDL-C水平,高脂組明顯高于基礎組(P<0.05)；RSV中劑量組明顯低于高

13、脂組(P<0.05)。各組HDL-C水平,TG水平無明顯差異(P>0.05)。
　　 四、抗氧化水平
　　 比較各組血清抗氧化水平,高脂組血清MDA水平明顯高于其他各組,RSV各組均降低了MDA水平,其中RSV中劑量組明顯低于高脂組(P<0.05)。各組血清GSH-Px水平,高脂組明顯低于基礎組,RSV中劑量組明顯高于高脂組(P<0.05)。比較各組血清SOD,T-AOC水平,各組間無明顯差異(P>0.05)。
　

14、　 比較各組肝臟抗氧化水平,RSV各組MDA水平均有所降低,其中RSV中劑量組明顯低于高脂組(P<0.05)。比較各組肝臟GSH-Px水平,高脂組,RSV低劑量組,RSV高劑量組均明顯低于基礎組(P<0.05)。比較各組肝臟SOD,T-AOC水平,各組間無明顯差異(P>0.05)。
　　 五、SITT1,LXR-α和ABCA1的mRNA表達水平
　　 各組間SIRT1,LXR和ABCA1的mRNA相對表達量無明顯差異(

15、P>0.05)。
　　 結論
　　 1、5mg/(kg·bw·d)RSV能夠降低高脂模型小鼠血清TC水平；22.5mg/(kg·bw·d)RSV能夠降低高脂模型小鼠血清LDL-C水平。
　　 2、各劑量組RSV均能降低MDA水平,其中22.5mg/(kg·bw·d)RSV能夠提高高脂模型小鼠GSH-Px酶活力。
　　 3、本研究條件下,未觀察到RSV對SIRT1的激活作用,以及間接調節(jié)LXR-α及其下游靶