UBE2B基因的一個新雜合突變與男性不育的關系.pdf

1、目的:
　　研究UBE2B基因啟動子突變與男性不育的關系;探討轉(zhuǎn)錄因子SP1對突變后的UBE2B基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響,進一步了解男性不育癥的發(fā)病機制。
　　方法:
　　(1)收集120例特發(fā)性無精子癥(IA)患者和120例有正常生育能力男性的血液標本,提取DNA:設計4對引物,PCR擴增距UBE2B基因編碼區(qū)上游2551bp長度的5’UTR區(qū)域和啟動子,擴增產(chǎn)物用ABI3730DNA測序儀進行測序分析,所發(fā)現(xiàn)的突變

2、用TRANSFAC真核生物轉(zhuǎn)錄因子分析軟件標記并與dbSNP135數(shù)據(jù)庫和1000Genomes數(shù)據(jù)庫進行比對。
　　(2)通過TRANSFAC真核生物轉(zhuǎn)錄因子分析軟件分析UBE2B啟動子,尋找與轉(zhuǎn)錄因子的潛在結合位點,構建UBE2B啟動子野生型(UBE2BWT)和突變體(UBE2Bmut)質(zhì)粒,將轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒(SP1)分別與野生型質(zhì)粒和突變體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Hela細胞和293T細胞,運用雙熒光素酶報告基因檢測突變體對轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性

3、的影響,及在突變體存在的情況下,轉(zhuǎn)錄因子對野生型UBE2B啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　(3)對受試的不育患者盡可能行睪丸活檢術,活檢睪丸組織制成石蠟切片,觀察睪丸生精情況,尤其是含有突變體的患者。
　　結果:
　　(1)對120例男性不育患者和120例正常男性的UBE2B基因啟動子區(qū)域測序分析,發(fā)現(xiàn)8個單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs),其中4個序列變異(Chr.133705424T>A,Chr.133706326A>G,

4、Chr.133706612C>T和Chr.133706626T>C)已被發(fā)現(xiàn),其余4個新的變異(Chr.133706771T>A,Chr.133706876T>G,Chr.133706925A>G和Chr.133706996T>G)在dbSNP135數(shù)據(jù)庫和1000基因組數(shù)據(jù)庫中均未見諸報道,在120例正常男性中也未發(fā)現(xiàn)這4種新的變異。
　　(2)TRANSFAC真核生物轉(zhuǎn)錄因子分析軟件檢測新發(fā)現(xiàn)的4個SNPs中,有3種突變(mu

5、t1Chr.133706771T>A,mut2Chr.133706876T>G,和mut3Chr.133706925A>G)位于轉(zhuǎn)錄因子SP1的結合區(qū)域,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)SP1能激活UBE2B啟動子WT,mut1,mut2的轉(zhuǎn)錄活性,不能激活mut3的轉(zhuǎn)錄活性;當mut3與WT共轉(zhuǎn)染時,SP1對UBE2BWT啟動子的轉(zhuǎn)錄活性明顯下降,提示mut3是通過顯性負效應原理來抑制SP1對UBE2BWT啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　(3