重組五步蛇毒纖溶酶Ⅱ?qū)Υ笫笾匕Y急性胰腺炎的作用.pdf

1、急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是由多種因?yàn)橐鹨让冈谝认賰?nèi)被激活而導(dǎo)致的以胰腺局部炎癥反應(yīng)為主、伴或不伴其它器官功能改變的疾病。AP通常有自限性,但約20％的病例會(huì)發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe AP,SAP),出現(xiàn)胰腺壞死和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。SAP死亡率在30％～50％,而且自上世紀(jì)70年代以來(lái)并沒(méi)有明顯降低。由于死亡

2、率高,病理生理機(jī)制不清,缺乏切實(shí)有效的特異性療法,SAP仍然是臨床上的一大難題。
　　 盡管SAP的確切機(jī)制尚未完全闡明,但大量促炎因子分泌入血和隨后形成的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)被認(rèn)為是SAP致死的主要因?yàn)?。其?腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)是首要的促炎因子,在SIRS中居于核心地位,對(duì)

3、SAP多器官損傷和病人死亡起著關(guān)鍵作用。很多證據(jù)表明,抗TNF-α治療在實(shí)驗(yàn)性胰腺炎中具有保護(hù)作用。
　　 重組纖溶酶Ⅱ(recombinant fibrinogenaseⅡ,rFⅡ)是本實(shí)驗(yàn)室從五步蛇(學(xué)名:尖吻蝮蛇,Agkistrodon Acutus)毒腺表達(dá)型cDNA文庫(kù)中表達(dá)純化的基因重組溶栓藥。它在體外能降解纖維蛋白和TNF-α,在敗血癥和彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coa

4、gulation,DIC)動(dòng)物模型上均有保護(hù)作用?；赥NF-α在SAP中的重要作用和rFⅡ降解TNF-α的前期實(shí)驗(yàn),本論文用rFⅡ治療SAP動(dòng)物模型并在體外進(jìn)一步確認(rèn)rFⅡ?qū)NF-α的作用。
　　 方法：
　　 用經(jīng)膽胰管逆行灌注5％?；悄懰徕c的方法,在雄性SD大鼠上建立SAP模型。大鼠隨機(jī)分成四組:對(duì)照(control,Con)組:膽胰管灌注生理鹽水,靜脈注射生理鹽水；模型(SAP)組:膽胰管灌注5％?；悄懰徕c,靜

5、脈注射生理鹽水；rFⅡ治療(rFⅡ)組:膽胰管灌注5％?；悄懰徕c,靜脈注射rFⅡ(1mg/kgBW)；Infliximab治療(Inf)組:膽胰管灌注5％?；悄懰徕c,靜脈注射Infliximab(8mg/kg BW)。給藥起始時(shí)間為病程的0.5h,總時(shí)程約3h。
　　 觀(guān)察各組大鼠24h內(nèi)的存活情況。
　　 取0、3、6、9、12h的大鼠血清樣品,用碘-淀粉比色法測(cè)定血清淀粉酶活性,用ELISA法檢測(cè)TNF-α、白細(xì)胞介

6、素(interleukin,IL)-1β、IL-6和IL-10的濃度。
　　 取12h的大鼠胰腺和右肺,測(cè)定濕干重比,進(jìn)行病理切片和病理學(xué)評(píng)分。取6h的大鼠腹水,測(cè)定腹水指數(shù)和腹水TNF-α濃度；分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠腹腔巨噬細(xì)胞；用四甲基偶氮唑藍(lán)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法測(cè)定各組大鼠腹腔滲出巨噬細(xì)胞(peritoneal e

7、xudatemacrophages,PEMs)的相對(duì)數(shù)量；測(cè)定各組大鼠PEMs培養(yǎng)12h后分泌的TNF-α和IL-1β濃度。
　　 在胰腺炎相關(guān)PEMs模型中,用1ng/ml rFⅡ作用不同時(shí)間和用不同濃度的rFⅡ作用1h,觀(guān)察rFⅡ?qū)NF-α和IL-1β分泌的影響。
　　 在胰腺炎相關(guān)腹水(pancreatitis-associated ascitic fluid,PAAF)誘導(dǎo)的固有腹腔巨噬細(xì)胞(resident

8、peritoneal macrophages,RPMs)模型中,用1μg/ml rFⅡ作用3h,觀(guān)察rFⅡ?qū)NF-α和IL-1β分泌的影響。
　　 在體外,將0.1μg rFⅡ分別與2.5μg人TNF-α、小鼠TNF-α和大鼠TNF—α在37℃孵育2h,用SDS-PAGE分析產(chǎn)物的情況。
　　 在體外,用不同濃度的rFⅡ與初始濃度為1000pg/ml的大鼠TNF-α和人TNF-α在37℃孵育1h,用ELISA法檢測(cè)剩余

9、TNF-α濃度,并繪制量效曲線(xiàn),計(jì)算rFⅡ?qū)煞NTNF-α的半數(shù)抑制濃度(inhibition concentration at50％effect,IC50)。
　　 結(jié)果：
　　 rFⅡ治療能夠顯著提高SAP大鼠的生存率(P=0.006),減輕胰腺和肺的損傷,抑制腹腔炎癥,降低血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的濃度。這些效果與Infliximab相似。
　　 在胰腺炎相關(guān)PEMs中,rFⅡ?qū)N

10、F-α分泌的抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性。在PAAF誘導(dǎo)的RPMs模型中,rFⅡ也能抑制TNF-α的分泌。rFⅡ在兩種細(xì)胞模型中均對(duì)IL-1β的分泌沒(méi)有影響。
　　 在37℃孵育2h,0.1μg rFⅡ能將2.5μg人TNF-α和小鼠TNF—α完全降解,但不能完全降解2.5μg大鼠TNF-α。在37℃孵育1h,rFⅡ?qū)?000pg/ml大鼠TNF—α的IC50為269.0(244.7～295.8)pg/ml,對(duì)1000pg/ml