重組五步蛇毒降纖酶的基因克隆、表達(dá)、純化及降纖研究.pdf

1、目的： 血漿纖維蛋白原是一種急性期反應(yīng)蛋白質(zhì)，在體內(nèi)易受遺傳和環(huán)境等多種因素的影響，例如：纖維蛋白原某些基因位點(diǎn)的改變(遺傳因素)，以及吸煙、手術(shù)或外傷、炎癥、感染、AMI等應(yīng)激情況(環(huán)境因素)均可使血漿纖維蛋白原水平反應(yīng)性升高。近年來，大量臨床和流行病學(xué)研究資料亦進(jìn)一步證實(shí)了血漿纖維蛋白原水平升高是血栓性疾病的一個(gè)誘發(fā)因素，適當(dāng)降低血漿纖維蛋白原對于預(yù)防心腦血管血栓性疾病是十分重要的，特別是對于高危個(gè)體狀態(tài)下高纖維蛋白原血癥的

2、效果更加顯著。 本課題組在以往的研究發(fā)現(xiàn)，我國獨(dú)有的五步蛇毒中含有直接降解纖維蛋白原的成分。臨床上常用的降纖酶是從蛇毒毒素中提取的蛋白質(zhì)，由于自然來源的蛇毒成分與生物活性存在著地域性、季節(jié)性變異，實(shí)際上難以取得穩(wěn)定的臨床療效；粗制品蛇毒中成分復(fù)雜，雖經(jīng)純化處理，仍難獲得真正單一的化學(xué)成分，使臨床應(yīng)用中存在毒副作用；而且自然蛇毒產(chǎn)量有限，成本較高等缺點(diǎn)，引導(dǎo)研究方向轉(zhuǎn)向用基因工程技術(shù)。目前，基因工程藥物主要從大腸桿菌和酵母真核細(xì)胞

3、中表達(dá)得到，大腸桿菌中表達(dá)的目的蛋白是以包涵體形式存在且無糖基化。甲醇營養(yǎng)型酵母作為一種新型外源基因表達(dá)系統(tǒng)，兼有原核細(xì)胞良好的可操作性和真核系統(tǒng)的翻譯后加工的雙重特點(diǎn)，是外源基因表達(dá)的理想宿主，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窃诋叧嘟湍钢袠?gòu)建表達(dá)五步蛇毒降纖酶基因，為基因工程降纖酶的生產(chǎn)探索一種新方法，并研制開發(fā)出可高活性地降解纖維蛋白原的重組降纖酶，并將其開發(fā)成具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的Ⅰ類新型基因工程藥物。 方法與結(jié)果： 1.五步蛇毒降纖

4、酶基因的克隆 本實(shí)驗(yàn)通過五步蛇毒降纖酶抗體篩選五步蛇毒腺cDNA文庫得到陽性克隆，進(jìn)行測序和同源性分析確定為降纖酶基因，PCR擴(kuò)增降纖酶基因(FibrinogenaseⅣ，F(xiàn)Ⅳ)，將FⅣ與質(zhì)粒pPIC9K進(jìn)行重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進(jìn)行篩選鑒定。經(jīng)過酶切和DNA序列測定，證實(shí)FⅣ基因正確插入pPIC9K質(zhì)粒中，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-FⅣ。 2.五步蛇毒降纖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá) 用SacI線形化

5、pPIC9K-FⅣ重組質(zhì)粒，并用電穿孔法轉(zhuǎn)染畢赤酵母KM71菌株，篩選和鑒定His+Muts轉(zhuǎn)化子，提取酵母基因組DNA，PCR檢測目的基因的整合，并進(jìn)行表達(dá)和產(chǎn)物免疫印記鑒定，對FibrinogenaseⅣ基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行初步分析，證實(shí)27kDa蛋白條帶為重組五步蛇毒降纖酶(recombinationFibrinogenaseⅣ，rFⅣ)。 3.基因重組降纖酶的發(fā)酵、純化及理化分析 在30升發(fā)酵罐上進(jìn)行高密度培養(yǎng)發(fā)酵試

6、驗(yàn)，對發(fā)酵工藝進(jìn)行考察，發(fā)酵過程中酵母細(xì)胞濕重達(dá)到200-300g/L，實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵的目的，經(jīng)過36小時(shí)的甲醇誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物活性達(dá)到最高。表達(dá)產(chǎn)物分別用離子交換層析和疏水層析進(jìn)行純化。對純化產(chǎn)物進(jìn)行等電點(diǎn)和糖基化檢測，初步證實(shí)它為非糖基化的、等電點(diǎn)為7.1的重組蛋白。 4.基因重組降纖酶的酶學(xué)研究 本實(shí)驗(yàn)我們研究了酶活性在不同影響因素下的作用，發(fā)現(xiàn)基因重組降纖酶rFⅣ在30-50℃的溫度處理15分鐘后，相對活性仍然維持

7、在80％以上；同時(shí)rFⅣ在pH4.5到11，相對活性維持在80％以上水平；一價(jià)金屬陽離子對rFⅣ的活性沒有影響，二價(jià)重金屬離子(Zn2+、Cu2+和Cd2+)在1mM濃度時(shí)對rFⅣ的活性都產(chǎn)生了明顯抑制作用，并隨著濃度增加抑制作用更加明顯；L-cysteine、PMSF、EDTA和DTT都可以不同程度的抑制rFⅣ的酶活性。與發(fā)色底物(N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Lys4-pNA)共同孵育測得的Km值是7.471×10-4mo

8、l/L，Vmax值是5.103×10-5mol/s。rFⅣ可降解纖維蛋白原的Aα、Bβ和γ鏈，這種降解作用隨著時(shí)間和濃度的增加而增強(qiáng)。 5.基因重組降纖酶對高纖維蛋白原血癥大鼠模型的降纖作用 為了衡量rFⅣ的急性毒性的大小，我們先測定了rFⅣ的半數(shù)致死量(LD50)，結(jié)果為LD50=62.76mg/kg。利用高纖維蛋白原血癥模型研究了rFⅣ在整體動(dòng)物上的降纖作用，結(jié)果顯示高、中、低劑量rFⅣ均具有明顯降低高纖維蛋白原血癥

9、大鼠模型的血漿纖維蛋白原作用，且這種作用隨著劑量增加而增強(qiáng)。 結(jié)論： 1.本研究構(gòu)建了pPIC9K-FⅣ重組質(zhì)粒，并成功實(shí)現(xiàn)了基因重組降纖酶rFⅣ在畢赤酵母中的表達(dá)。為生產(chǎn)過程和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2.實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建篩選了Muts表型的FⅣ/KM71畢赤酵母表達(dá)菌株，可實(shí)現(xiàn)短時(shí)間、高密度、大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)，并對其純化工藝進(jìn)行了研究，這對實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)有重要意義。 3.rFⅣ在高纖維蛋白原血癥整體動(dòng)物模型中