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文檔簡介
1、急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)為臨床常見危重疾病。盡管臨床對急性腺炎的診療水平不斷提高,但重癥急性胰腺炎(Severe acutepancreatitis。SAP)的死亡率仍高達10%-30%。SAP時,大量炎癥細胞被過度激活并釋放白介素-1、6、10(Interleukin-1、6、10,IL-1、6、10)等炎癥因子,從而啟動全身炎癥反應和調控胰腺組織細胞凋亡。因此在SAP早期控制炎癥反應和細胞凋亡,能大大
2、減輕胰腺損傷,提高患者的生存率和改善預后。近年研究發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)中藥蓽茇根部提取物蓽撥寧(piperlonguminine,PL)通過影響活性氧簇(Reactive oxygen specie s,ROS)、部分凝血活酶時間和ERK-1/2信號通路等,在修復腦神經損傷、抗凝血活性和抑制腫瘤細胞生長等方面均有調控作用。本課題旨在中醫(yī)藥理論指導下,運用現(xiàn)代分子生物學技術,進行中醫(yī)藥治療SAP機理及其分子基礎的研究,尤其是探討中藥新藥-蓽撥寧治療
3、SAP的作用靶點及其可能的相關分子機制,為今后開發(fā)新的中醫(yī)藥治療SAP提供理論依據(jù)。
目的:
建立SAP大鼠模型,探討中藥蓽撥根部提取物蓽撥寧單體對SAP大鼠的作用及其相關分子機制,為進一步開發(fā)該蓽撥寧提供實驗依據(jù)。
方法:
1.動物的分組與處理
1.1.動物模型的分組:60只SD大鼠按數(shù)字表法隨機分成假手術(SO)組(10只),模型(SAP)組(10只),蓽茇寧(P)組(30只),甲磺
4、酸加貝酯(GM)組(10只)。
1.2動物分組后處理:采用逆行胰膽管注射5%牛黃膽酸鈉(0.1ml/100g)建立SAP大鼠模型。SO組以生理鹽水代替5%牛黃膽酸鈉。P組于建模后隨機分成低、中、高劑量組(2.5,5,10mg.kg-1)并立即將蓽茇寧以腹腔注射形式給藥SAP大鼠。GM組建模后立即將甲磺酸加貝酯(gabexate mesilate,GM)(10mg.kg-1)以腹腔注射形式給藥SAP大鼠。而SO組和SAP組用等量
5、的生理鹽水以腹腔注射形
式注入大鼠。12h后處死大鼠留取血清及胰腺組織標本。
2.實驗觀察指標
2.1.第一部分實驗觀察指標:12h后觀察大鼠術后一般狀態(tài)。隨后處死大鼠留取部分胰腺組織干燥箱烤至恒重后檢測干濕比重。觀察胰腺頭部組織病理學大體改變及HE染色鏡下觀改變。紫外分光光度計檢測:大鼠血清淀粉酶(Amylase。AMS)、脂肪酶(Lipase。LPS)變化。
2.2.第二部分實驗觀察指標:紫外
6、分光光度計檢測:大鼠血清髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)變化。ELISA法檢測:大鼠血清干擾素-γ(Interferon-γ,I FN-γ)、白介素-1(Interferon-1β,IL-1β)、白介素-10(Interferon-10,IL-10)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α。TNF-α)變化。定量PCR檢測:胰腺組織TLR-4 mRNA和NF-κB mRNA變化。蛋白質印跡法檢
7、測:胰腺組織TLR-4蛋白和NF-κB蛋白表達量變化。
2.3.第三部分實驗觀察指標:TUNNEL染色檢測:大鼠胰腺組織細胞凋亡情況。定量PCR檢測:peroxiredoxin-4 mRNA、XBP-1 mRNA和p38MAPmRNA表達量變化。蛋白質印跡法檢測:peroxiredoxin-4蛋白表達量變化。
結果:
1.實驗結果
1.1.第一部分實驗結果:
(1)總體上SO組大鼠一般狀
8、態(tài)良好,SAP組大鼠狀態(tài)萎靡,P組及GM組大鼠狀態(tài)較SAP組好轉。
?。?)SAP組大鼠血清AMS和LPS值較SO組升高3倍以上。P組、GM組AMS和LPS水平較SAP組下降(P>0.05)。
?。?)SAP組大鼠胰腺組織干濕比重值較SO組明顯升高(P<0.05)。P組和GM組大鼠胰腺組織干濕比重值較SAP組下降(P<0.05)。
?。?)病理切片大體及鏡下結果顯示,SAP組大鼠胰腺損傷較SO組嚴重。P組和GM組
9、大鼠胰腺損傷較SAP組減輕。
1.2.第二部分實驗結果:
?。?)MPO水平結果顯示:SAP組大鼠血清MPO表達水平較SO組明顯升高(P<0.05),P組、GM組較SAP組有下降趨勢,但差異均沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
?。?)ELISA結果顯示:SAP組大鼠血清IL-1β、TNF-α和IFN-γ表達水平較SO組明顯升高(P<0.05,0.01)。P組、GM組IL-1β、TNF-α和IFN-γ表達水平較S
10、AP組均顯著降低(P<0.05,0.01);雖SAP組的IL-10表達水平較SO組升高,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而P組、GM組IL-10表達水平較SAP組顯著升高(P<0.05)。
?。?)定量PCR結果顯示:SAP組大鼠胰腺TLR-4 mRNA和NF-κB mRNA較SO組表達量明顯升高(P<0.05,0.01)。P組、GM組胰腺組織TLR-4 mRNA和NF-κB mRNA表達量較SAP組顯著降低(P<0.05)。<
11、br> ?。?)蛋白質印跡法結果顯示:SAP組大鼠胰腺T LR-4和NF-κB蛋白表達量較SO組明顯升高。P組、GM組胰腺組織TLR-4和NF-κB蛋白表達量較SAP組顯著降低。
1.3.第三部分實驗結果:
?。?)TUNNEL染色結果顯示:SAP大鼠胰腺細胞凋亡程度較SO組增加。P組和GM組大鼠胰腺組織凋亡程度較SAP組增加。
?。?)定量PCR結果顯示:SAP組大鼠胰腺peroxiredoxin-4 mRN
12、A、XBP-1 mRNA和p38MAPK mRNA表達量較SO組明顯升高(P<0.05,0.01)。P組、GM組胰腺組織p38MAPK mRNA表達量較SAP組顯著升高(P<0.05),XBP-1 mRN A表達量較SAP組有上升趨勢,但差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05),peroxired oxin-4 mRNA蛋白表達量較SAP組顯著降低(P<0.05)。
?。?)蛋白質印跡法結果顯示:SAP組大鼠胰腺peroxiredox
13、in-4蛋白表達量較SO組明顯升高。P組、GM組胰腺組織peroxiredoxin-4蛋白表達量較SAP組顯著降低。
結論:
大鼠SAP模型建立成功。蓽撥寧能降低AMS、LPS的表達量,抑制SAP相關的炎癥因子(IL-1β、IL-10、TNF-α、IFN-γ)表達、具有緩解SAP病情的作用。其作用機制可能通過調節(jié)TLR-4/NF-κB通路和細胞凋亡,而減輕炎癥反應。但其對SAP大鼠MPO參與的氧化應激反應及XBP-1
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