靶向性基因治療在肝癌及器官移植中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景：
　　 靶向性基因治療作為一種新的治療手段受到越來越多的關(guān)注。選擇適當(dāng)?shù)陌邢驒C(jī)制可以提高載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染率，保證目的基因表達(dá)和對(duì)目的細(xì)胞殺傷的同時(shí)，減少對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞的影響。
　　 有效的載體系統(tǒng)是靶向性基因治療成功的關(guān)鍵因素之一。在普遍使用的載體系統(tǒng)中，非病毒載體(non-viral vector)的安全性較病毒載體(viral vector)有了很大的提高。靶向性納米聚合物作為基因傳輸及疾病診斷試劑的載體受到了

2、日益密切的關(guān)注。生物醫(yī)用高分子材料由于其在作為非病毒載體的同時(shí)可以具備靶向載體及造影劑等功能而備受關(guān)注。聚乙烯亞胺(PEI)是一種經(jīng)典而有效的陽(yáng)離子聚合物非病毒載體?；诔槾判匝趸F(super paramagnetic ironox ide，SPIO)的納米顆粒是主要的MRI分子探針，已在探測(cè)腫瘤分子和細(xì)胞水平的變化中顯示出不可替代的優(yōu)越性。
　　 原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，由于其高死亡率而嚴(yán)重危害患者的健康。原發(fā)

3、性肝癌首選的治療方法是手術(shù)切除，但由于起病隱匿，多數(shù)的肝癌患者就診時(shí)已達(dá)中晚期，且多伴有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和/或門脈癌栓，手術(shù)切除的機(jī)會(huì)很少。目前的一些治療方法如射頻消融、微波、無水乙醇瘤內(nèi)注射、放療、生物治療等效果有限。因此臨床醫(yī)生和科研工作者正在努力尋找包括靶向治療等更好的治療方法，并從肝癌發(fā)生發(fā)展的基因調(diào)控機(jī)制中尋找新的藥物靶點(diǎn)，以求提高對(duì)肝癌的診治能力。本研究設(shè)計(jì)了葉酸受體靶向的納米載體，對(duì)其在肝細(xì)胞癌基因治療和診斷的作用進(jìn)行了有意義的探

4、討。
　　 肝移植術(shù)也是一種針對(duì)原發(fā)性肝癌徹底而有效的治療手段，但術(shù)后發(fā)生的急慢性排斥反應(yīng)是臨床器官移植中難以克服的問題。長(zhǎng)期使用免疫抑制劑會(huì)帶來許多嚴(yán)重副作用。本研究利用靶向性載體，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在活體實(shí)驗(yàn)中抑制急性排斥反應(yīng)，為臨床誘導(dǎo)免疫耐受的新方法提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 本文設(shè)計(jì)和研究了幾種可以用于傳輸基因及腫瘤診斷試劑的聚合物，并從腫瘤及器官移植急性排斥反應(yīng)的診斷及治療角度對(duì)其作用

5、進(jìn)行探討。
　　 方法：
　　 1.構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3-p53，并鑒定該重組質(zhì)粒構(gòu)建正確；
　　 構(gòu)建靶向性Fa-PEG-PEI-SPIO共聚物對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行復(fù)合，并利用凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)，粒徑與電位的測(cè)量，觀察Fa-PEG-PEI-SPIO/pEGFP-N3-p53的復(fù)合效果；
　　 檢測(cè)納米復(fù)合物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的毒性、轉(zhuǎn)染效果及p53蛋白表達(dá)的影響；
　　 建立裸鼠SMMC

6、-7721移植瘤，對(duì)Fa-PEG-PEI-SPIO/pEGFP-N3-p53及PEG-PEI-SPIO/pEGFP-N3-p53共聚物的治療及MRI顯像效果進(jìn)行觀察與比較。
　　 2.構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcdna3.1-DGK-C-3xflag，并鑒定該重組質(zhì)粒構(gòu)建正確；
　　 將T細(xì)胞特異性配體CD3單鏈抗體(scAbCD3)連接到載體PEG-PEI-SPIO的PEG端(scAbCD3-PEG-PEI-SPIO)，構(gòu)建靶

7、向性scAbCD3-PEG-PEI-SPIO共聚物并復(fù)合該質(zhì)粒。觀察scAbCD3-PEG-PEI-SPIO/pcdna3.1-DGK-C-3xflag的復(fù)合效果；
　　 建立大鼠同種異體異位心臟移植急性排斥模型(BN-to-Lew)，對(duì)靶向性納米復(fù)合物scAbCD3-PEG-PEI-SPI0/pcdna3.1-DGK-C-3xflag與非靶向性納米復(fù)合物PEG-PEI-SPIO/pcdna3.1-DGK-C-3xflag的治療

8、效果和顯像作用進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功建立真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3-p53，并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證；
　　 構(gòu)建靶向性Fa-PEG-PEI-SPIO共聚物，并確定其與pEGFP-N3-p53質(zhì)粒復(fù)合時(shí)的最佳N/P為10時(shí)復(fù)合效果最好，而且在SMMC-7721細(xì)胞中有良好的轉(zhuǎn)染效果，p53蛋白的表達(dá)情況也較非靶向性材料PEG-PEI-SPIO為好；
　　 在裸鼠移植瘤中，F(xiàn)a-PEG-PEI-S

9、PIO/pEGFP-N3-p53表現(xiàn)出良好的MRI顯像效果及腫瘤生長(zhǎng)抑制效果。
　　 2.成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcdna3.1-DGK-C-3xflag；
　　 構(gòu)建T細(xì)胞靶向性載體scAbCD3-PEG-PEI-SPIO，并于N/P為10時(shí)復(fù)合質(zhì)粒取得良好效果；
　　 在大鼠同種異體異位心臟移植急性排斥模型中，scAbCD3-PEG-PEI-SPIO的MRI顯像效果明顯好于非靶向材料PEG-PEI-SPIO，而