腫瘤靶向性腺病毒載體的構(gòu)建及其在腫瘤基因治療中的應(yīng)用.pdf

1、本研究旨在建立一種靶向EGFR的基因?qū)胂到y(tǒng)，通過(guò)一個(gè)雙功能連接分子引導(dǎo)腺病毒到達(dá)高表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞表面，從而提高腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的感染效率，降低其對(duì)正常組織細(xì)胞的損害，為腫瘤的靶向性基因治療提供可靠的理論依據(jù)與實(shí)踐指導(dǎo)。 第一部分 腫瘤細(xì)胞表面受體表達(dá)水平與腺病毒感染效率的關(guān)系 [目的]探討腫瘤細(xì)胞表面腺病毒-柯薩奇病毒受體(CAR)、整合素(integrin)和CD46的表達(dá)水平與不同血清型腺病毒感染效率

2、的關(guān)系，為下一步研究腺病毒靶向基因治療奠定基礎(chǔ)。 [方法]采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，Westernblot，流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色等方法檢測(cè)幾種不同細(xì)胞系來(lái)源的腫瘤細(xì)胞表面腺病毒-柯薩奇病毒受體(CAR)、整合素(integrin)和CD46的表達(dá)水平。用攜帶指示基因GFP或者Luciferase的腺病毒Ad5-CMV-GFP、Ad5F35-CMV-GFP和Ad5-CMV-luc感染腫瘤細(xì)胞，流式細(xì)胞儀和lucife

3、raseAssay測(cè)定GFP及l(fā)uciferase表達(dá)水平，確定腺病毒感染率和外源基因表達(dá)水平。通過(guò)轉(zhuǎn)染CAR的真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)提高腫瘤細(xì)胞表面CAR的表達(dá)，以及采用CAR和integrin抗體分別封閉細(xì)胞表面受體，或用抗knob抗體先與腺病毒結(jié)合，阻斷腺病毒感染腫瘤細(xì)胞，然后檢測(cè)并比較腺病毒感染效率的變化。 [結(jié)果]分別用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，Westernblot，流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色等方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞表面腺病

4、毒-柯薩奇病毒受體和整合素的表達(dá)水平，不同腫瘤細(xì)胞表面CAR和integrin的表達(dá)水平是不同的，幾種方法檢測(cè)所得結(jié)果是基本一致的，其中SMMC-7721和A549細(xì)胞CAR的表達(dá)量最高，而K562細(xì)胞CAR的表達(dá)水平最低；所檢測(cè)的幾種腫瘤細(xì)胞integrin都有一定的表達(dá)，其中SK-OV-3和A549細(xì)胞的integrin表達(dá)最高，而K562表達(dá)最低。 熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ad5-CMV-GFP和Ad5F35-CMV-G

5、FP對(duì)腫瘤細(xì)胞的感染效率，結(jié)果顯示5型腺病毒對(duì)于SMMC-7721和A549細(xì)胞的感染效率最高，而對(duì)于HXO-RB44和K562則很低。5型腺病毒的感染效率與細(xì)胞表面CAR和integrin的表達(dá)水平呈正相關(guān)。 成功構(gòu)建了表達(dá)腺病毒-柯薩奇病毒受體(CAR)的重組質(zhì)粒pCDNA3.1-fCAR，用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染各種腫瘤細(xì)胞后，可使5型腺病毒的感染效率大幅度提高，其中對(duì)A549感染效率提高了約10倍，對(duì)SK-OV-3提高了4.4倍

6、，對(duì)于K562提高了3.4倍，對(duì)HXO-RB44和SMMC-7721分別提高了1.8倍和1.2倍。 用抗CAR和knob的抗體阻斷腺病毒對(duì)SMMC-7721和SK-OV-3的感染，相同的抗體濃度下，腺病毒對(duì)SMMC-7721感染效率的降低比SK-OV-3更為顯著。在應(yīng)用抗integrin抗體阻斷時(shí)，腺病毒對(duì)SMMC-7721和SK-OV-3的感染效率都顯著下降，對(duì)于SK-OV-3的阻斷更為明顯。 [結(jié)論]腫瘤細(xì)胞表面CA

7、R和integrin的表達(dá)水平與5型腺病毒感染細(xì)胞的效率呈正相關(guān)。通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA3.1-fCAR人為提高腫瘤細(xì)胞表面CAR的表達(dá)水平，能夠使腺病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率顯著提高。用抗CAR、knob或者是integrin的抗體阻斷腺病毒感染，可顯著降低腺病毒的感染效率，其中抗integrin抗體所阻斷的感染效率最為顯著，說(shuō)明integrin在病毒的感染中起著非常重要的作用。 第二部分 雙功能融合分子對(duì)腺病毒的感染效率的提

8、高 [目的]為了提高腺病毒載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的感染效率，我們根據(jù)大多數(shù)的實(shí)體瘤細(xì)胞EGFR表達(dá)上調(diào)的特點(diǎn)，構(gòu)建了能夠表達(dá)融合蛋白sCAR-EGF的腺病毒載體，探討該融合分子對(duì)于提高腺病毒感染腫瘤細(xì)胞效率的作用。為提高腺病毒介導(dǎo)的治療基因的腫瘤靶向性傳遞效率提供新的手段和工具。 [方法]采用PCR和體外連接的方法構(gòu)建了腺病毒-柯薩奇病毒受體胞外段(solubleCoxsackieBvirus-AdenovirusRecepto

9、r)sCAR和表皮生長(zhǎng)因子(EpidermalGrowthFactor)EGF融合基因，然后將此融合基因插入穿梭質(zhì)粒pDC315。利用Ad-MAX腺病毒包裝系統(tǒng)，將重組穿梭質(zhì)粒pDC315-sCAR-EGF與攜帶腺病毒主要基因的大質(zhì)粒pBHGloxΔE13cre共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝出表達(dá)融合蛋白sCAR-EGF的腺病毒。用攜帶報(bào)告基因的腺病毒Ad5-CMV-GFP和Ad5-CMV-luc檢測(cè)雙功能融合分子對(duì)于提高腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞感染

10、效率和外源基因表達(dá)水平的作用。分別采用抗EGFR和抗CAR抗體與腺病毒孵育，檢測(cè)抗體阻斷對(duì)于融合分子介導(dǎo)的腺病毒感染的作用。 [結(jié)果]成功包裝出一種復(fù)制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-sCAR-EGF。經(jīng)PCR鑒定該病毒含有sCAR-EGF融合基因片斷，Westernblotting證實(shí)該病毒能表達(dá)sCAR-EGF融合蛋白。體外試驗(yàn)證實(shí)該病毒感染及其所產(chǎn)生的融合蛋白能夠引導(dǎo)攜帶指示基因的腺病毒Ad5-CMV-luc高水平感染腫瘤細(xì)胞

11、，對(duì)SK-OV-3細(xì)胞的感染效率提高了約30倍，對(duì)A549細(xì)胞也提高了約9倍，感染效率的提高與腫瘤細(xì)胞表面EGFR表達(dá)水平呈相關(guān)，也與雙功能分子的劑量存在明顯的相關(guān)性，抗EGFR抗體能有效阻斷腺病毒的感染，而抗CAR抗體的阻斷作用不明顯。 [結(jié)論]融合分子sCAR-EGF可明顯提高了腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的感染效率?？笶GFR抗體能有效阻斷腺病毒的感染，而用抗CAR的抗體阻斷作用不明顯，說(shuō)明經(jīng)過(guò)融合分子介導(dǎo)腺病毒的吸附內(nèi)吞不再依賴(lài)其天