鼻咽癌的靶向性放射增敏基因治療.pdf

1、目的：構建放射敏感的融合啟動子E6hTERTp，觀察在不同放射劑量誘導下放射敏感增強子增強hTERTp（人端粒酶催化亞基啟動子）啟動下游基因轉錄活性及對特異性的影響；并進一步構建含E6hTERTp以及融合UL49片段的自殺基因CD/UPRT.UL49的質粒載體，放射干預誘導其在鼻咽癌CNE-2細胞表達，觀察放射條件下該自殺基因/前藥系統(tǒng)在鼻咽癌細胞中的體內以及體外放射增敏效應，為探索新的鼻咽癌放射基因治療奠定實驗基礎。 方法和結

2、果： 第一部分：放射誘導型增強子E6對hTERTp靶向性增敏效應研究 方法：overlap PCR擴增融合啟動子E6hTERTp以及CD/UPRT.UL49片段。基因重組技術構建融合啟動子E6hTERTp的報告基因載體PGL3-E6hTERTp，以EGR-1p（早期生長反應因子1啟動子）以及hTERTp為對照，經(jīng)脂質體介導重組質粒與pRL-SV40質粒共轉染鼻咽癌CNE-2細胞以及正常人成纖維細胞（HDF），不同放射劑量

3、（0，2，6，10gy）誘導下通過雙熒光素酶分析系統(tǒng)檢測報告基因的表達效率，研究不同放射劑量對各啟動子啟動下游基因轉錄活性及對其特異性的影響；構建自殺基因載體pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49以及pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT，脂質體介導轉染鼻咽癌CNE-2細胞，在0gy，2Gy，6gy，10gy等不同放射條件下，半定量RT-PCR法檢驗其轉錄活性，免疫印跡法檢測CD/UPRT.

4、UL49以及CD/UPRT蛋白表達； 結果：雙熒光素酶分析系統(tǒng)檢測顯示，正常HDF細胞系中，轉染PGL3-E6.hTERTp組以及PGL3-hTERTp組無論照射與否，其啟動活性均維持在極低水平；在給予0Gy，2Gy，6Gy，以及10Gy放射干預之后，轉染CNE-2細胞的各啟動子活性均隨放射劑量的增加而增加，其中，轉染E6.hTERTp各放射劑量組啟動活性分別為18，8184±4.1969，102.6512±20.5879，29

5、1.7274±35.4752，407.5505±27.1526，放射組比較未放射組分別增加了5.4倍，15.2倍和21.7倍，各放射組兩兩間同樣有顯著性差異（p<0.05）。E6.hTERTp2Gy組、6Gy組以及10Gy組啟動活性分別是hTERTp相同放射劑量組的2.4倍，3.5倍和2.8倍，兩個啟動子組間差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05），證實鼻咽癌CNE-2細胞中，放射誘導型增強子E6能夠明顯提高hTERTp放射敏感性，且不影響其

6、腫瘤特異性。 自殺基因載體pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49以及pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT轉染CNE-2細胞后，WESTERN BLOTTING顯示檢測到的特異性蛋白條帶。RT-PCR檢測顯示所有經(jīng)照射后的實驗組mRNA量均要顯著高于未照射組（p<0.05），其中CD/UPRT在6Gy時出現(xiàn)最高值，而CD/UPRT.UL49在6Gy和10Gy處理下，mRNA量沒有顯著

7、差別（p>0.05），但均高于0Gy，2Gy時mRNA轉錄量（p<0.05）；證實放射干預可激發(fā)融合啟動子E6hTERTp啟動下游自殺基因表達。 第二部分啟動子E6hTERTp介導的自殺基因CD/UPRT.UL49以及CD/UPRT表達對鼻咽癌放射--基因治療增敏效應的體外實驗 方法：自殺基因載體pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49以及pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT

8、經(jīng)脂質體介導轉染鼻咽癌CNE-2細胞，在0gy，2Gy，6gy，10gy等不同放射條件下，高效液相色譜法檢測其促進前藥系統(tǒng)5-Fc（5-氟胞嘧啶）轉化為5-FU（5-氟尿嘧啶）的效率，MTT（四甲基偶氮唑藍）法檢測不同放射劑量下，不同濃度5-Fc對轉染自殺基因載體的的CNE-2細胞的殺傷效應并進行兩種不同基因治療組之間以及各基因治療組與單純放射治療組之間細胞存活率對比，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行分析。 結果：給予前藥5-Fc以及

9、放射干預后，高效液相色譜法檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過照射后轉染自殺基因載體pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT以及pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49載體的孔中均檢測到5-Fu，未照射孔沒有檢測到5-Fu； MTT檢測，單純前藥干預濃度為200ug/ml時，細胞生存率為93.04；轉染自殺基因載體后，前藥濃度為200（ug/ml），給予2Gy，6Gy，10Gy放射干預，CNE-2細胞存活率

10、較野生CNE-2細胞組均明顯下降（p<0.05）；放射劑量為2Gy以及10Gy時轉染pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49組比較轉染pcDNA3.1（-）E6.hTERTp。CD/UPRT組放射增敏效果更明顯（p<0.05）。 第三部分前體藥物/自殺基因系統(tǒng)對鼻咽癌放射增敏的原位基因治療實驗研究 方法：CNE-2細胞接種裸鼠皮下建立鼻咽癌動物模型，進行脂質體包裹質粒DNA瘤內注射的原位基因（i

11、n situ）治療實驗，待腫瘤長寬徑達到0.7-1.0cm時，將裸鼠隨機分組，瘤內注射脂質體包裹的DNA質粒，以及腹腔注射5-FC，并給予腫瘤局部每天3Gy照射，總劑量9Gy。記錄腫瘤體積，比較不同處理組的抑瘤效應；病理切片證實腫塊性質。抽提腫瘤組織RNA，RT-PCR反應，鑒定CD/UPRT.UL49基因在腫瘤組織內是否有表達。 結果：1×107CNE-2細胞接種裸鼠后，9天內均順利成瘤。未經(jīng)放射的自殺基因pcDNA3.1（-

12、）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49/前藥治療組沒有明顯抑瘤效果；放射-自殺基因pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49/前藥治療組生長抑制率93.7579，優(yōu)于其他各放射組（p<0.05），而放射-自殺基因pcDNA3.1（-）E6.hTERTp.CD/UPRT/前藥治療組生長抑制率88.86427，較其放射治療對照組沒有差別（p>0.05）。病理切片檢查各放射組均出現(xiàn)嚴重壞死。 結論：E6