容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯通道在大鼠基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期中的作用.pdf

1、腦動(dòng)脈重塑是高血壓發(fā)展過程中引起腦卒中重要因素，血管重塑涉及到血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥及纖維化等多重復(fù)雜的過程，其中動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增生和肥大被認(rèn)為是動(dòng)脈血管重塑的最重要特征，其表現(xiàn)為血管平滑肌細(xì)胞的數(shù)目增多以及細(xì)胞體積的增大。因此研究引發(fā)腦動(dòng)脈血管平滑肌增殖的機(jī)制是研究預(yù)防和治療腦血管病變的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。 ClC-3氯通道屬于電壓依賴性氯通道家族β亞族，ClC-3Cl-蛋白廣泛分布與腦、腎臟、肺、整個(gè)脈管等組織器官。近

2、來(lái)ClC-3Cl-蛋白在細(xì)胞增殖過程中的作用引起重視，我們實(shí)驗(yàn)室在大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，ET-1能促進(jìn)ClC-3蛋白的表達(dá)，這一作用與其促細(xì)胞增殖反應(yīng)呈正相關(guān)性，而ClC-3反義寡核苷酸可呈濃度依賴性抑制ET-1引起的內(nèi)源性ClC-3蛋白表達(dá)以及3H-胸腺嘧啶摻入，二者存在相關(guān)性。說明ClC-3通道參與了血管平滑肌細(xì)胞增殖過程。ET-1和其他血管活性因子可促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的ClC-3mRNA的表達(dá)，同時(shí)ClC-3蛋白能被生

3、長(zhǎng)因子上調(diào)也在前列腺癌細(xì)胞系以及淋巴細(xì)胞上得到證實(shí)，在體研究方面我們實(shí)驗(yàn)室在兩腎兩夾的腎性高血壓的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，隨著血壓的增加，基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞容積增大，低滲誘導(dǎo)氯通道開放增強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氯外流增加，與此同時(shí)腦基底動(dòng)脈平滑肌表達(dá)ClC-3蛋白表達(dá)增加。ClC-3也被報(bào)道參與肺動(dòng)脈高壓引起的右心室重塑，這些資料說明ClC-3氯通道介導(dǎo)的氯運(yùn)動(dòng)參與細(xì)胞增殖等容量的變化相關(guān)的病理生理過程。 本課題擬在回答三方面問題：1)ClC-

4、3氯通道是否參與腦基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖?2)ClC-3氯通道對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程如何影響，是否調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，以及影響哪些細(xì)胞周期相關(guān)的信號(hào)通路?如何影響?3)直接激活VRCC對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響，由哪些信號(hào)介導(dǎo)?ClC-3氯通道在VRCC調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖中的作用。 第一部分ClC-3氯通道蛋白在大鼠腦基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用 1.StealthsiRNA對(duì)基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)源性及ET-1誘導(dǎo)的ClC-

5、3蛋白表達(dá)的作用 Westernblot分析表明大鼠腦基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞上有內(nèi)源性ClC-3氯通道蛋白表達(dá)，分子量為80-100kDa。10nmol·L-1ET-1處理48小時(shí)后ClC-3蛋白表達(dá)增加到比未給ET-1刺激的對(duì)照組的2.05±0.21倍。 為了沉默ClC-3蛋白表達(dá)，我們?cè)O(shè)計(jì)了三對(duì)StealthsiRNA片斷分別轉(zhuǎn)染入腦基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞。 2.沉默ClC-3蛋白對(duì)基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖

6、的影響 用細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT(WST-8新一代MTT)試驗(yàn)分析細(xì)胞增殖。MTT分析細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果表明：同對(duì)照組相比，基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞MTT的代謝率在ET-1處理組、ET-1+lipofectamine處理組、ET-1+negativesiRNA處理組、ET-1+ClC-3siRNA處理組分別增加1.54±0.17、1.52±0.12、1.51±0.18倍及1.09±1.10倍，siRNA沉默ClC-3蛋白表達(dá)后ET-1誘導(dǎo)的細(xì)

7、胞數(shù)目增加以及MTT代謝增加分別被抑制。 3.過表達(dá)ClC-3蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將ClC-3全長(zhǎng)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞可明顯增加ClC-3蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明：iipofectamine對(duì)照組、pcDNA3.1質(zhì)粒對(duì)照處理組、ET-1+pcDNA3.1質(zhì)粒處理組，ET-1+CIC-3pcDNA處理組中細(xì)胞的MTT代謝率分別為空白對(duì)照組的0.95±0.07、1.01±0.1、1.45±0.08倍、1

8、.75±0.07倍，表明外源性轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)ClC-3cDNA后使之過表達(dá)后可加快ET-1誘導(dǎo)的基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的速度。 小結(jié)： 1)大鼠腦基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上有內(nèi)源性ClC-3氯通道蛋白表達(dá)，分子量80-100KD，ET-1可誘導(dǎo)ClC-3氯通道蛋白表達(dá)。 2)沉默ClC-3氯通道抑制ET-1誘導(dǎo)的基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。 3)ClC-3過表達(dá)加快ET-1誘導(dǎo)的基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。 以上結(jié)果

9、提示ClC-3氯通道可促進(jìn)基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。 第二部分沉默ClC-3對(duì)細(xì)胞周期的影響以及相關(guān)機(jī)制。 1.沉默ClC-3蛋白對(duì)基底動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示：siRNA沉默ClC-3表達(dá)后G0/G1期的細(xì)胞數(shù)目比例從62.67±2.90％增加到78.87±4.36％，與之對(duì)應(yīng)S期的細(xì)胞數(shù)目比例從32.68±3.64％下降到17.04±2.17％。 2.沉默ClC-3蛋

10、白對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的影響 同空白對(duì)照組相比，基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞cyclinD1的表達(dá)在ET-1處理組、ET-1+lipofectamine處理組、ET-1+negativesiRNA處理組、ET-1+ClC-3siRNA處理組分別增加，表明ET-1能明顯增加細(xì)胞的cyclinD1的表達(dá)，ClC-3被沉默后，ET-1的這個(gè)效應(yīng)明顯受到抑制。 同空白對(duì)照組相比，基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞cyclinE表達(dá)在ET-1處理組、ET-1

11、+lipofectamine處理組、ET-1+negativesiRNA處理組、ET-1+ClC-3siRNA處理組分別增加，表明ET-1能明顯增加細(xì)胞的cyclinE的表達(dá)，如果ClC-3被沉默ET-1的這個(gè)效應(yīng)受到抑制。 與空白對(duì)照組相比，基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞P21，P27的表達(dá)在ET-1處理組分別減少，表明ET-1能明顯抑制P21，P27的表達(dá)，沉默ClC-3可以逆轉(zhuǎn)ET-1對(duì)這兩個(gè)蛋白表達(dá)的影響。 3.沉默ClC-

12、3蛋白對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的影響 為了進(jìn)一步分析沉默ClC-3表達(dá)后對(duì)細(xì)胞周期影響的原因，我們檢查與血管平滑肌細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換調(diào)控相關(guān)的磷酸化信號(hào)通路，結(jié)果表明同對(duì)照組相比，ET-1能誘導(dǎo)基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ERK1/2的磷酸化，10min就有明顯增加，1小時(shí)后達(dá)到高峰，隨后磷酸化水平下降，12小時(shí)后下降到接近基礎(chǔ)水平，當(dāng)ClC-3表達(dá)沉默后，ET-1也能誘導(dǎo)ERK1/2的磷酸化但是其程度明顯比未沉默組明顯減弱。

13、小結(jié)： 1)沉默ClC-3氯通道阻止大鼠基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞周期從G0/G1期進(jìn)入S期，阻止DNA的合成。說明ClC-3氯通道參與基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)。 2)沉默ClC-3抑制細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1和cyclinE表達(dá)，增加P21，P27表達(dá)。 3)沉默ClC-3抑制ERK1/2的磷酸化，沉默ClC-3抑制Akt308、473位點(diǎn)和GSK3β的ser9位點(diǎn)磷酸化。說明ClC-3通過這些

14、磷酸化信號(hào)通路影響細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換。 第三部分ClC-3通道在低滲激活VRCC后引起細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制 1.低滲激活VRCC對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響及ClC-3蛋白在該過程中的作用 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞G0/G1期的細(xì)胞數(shù)目比例在等滲對(duì)照組、低滲培養(yǎng)處理組、低滲+negativesiRNA處理組、低滲+ClC-3siRNA處理組處于S期的細(xì)胞數(shù)目比例在分別在等滲對(duì)照組、低滲培養(yǎng)處

15、理組、低滲+negativesiRNA處理組、低滲+ClC-3siRNA處理組分別為11.24±3.92％、30.14±5.48％、31.43±5.12％、12.31±5.09％。siRNA沉默ClC-3表達(dá)后G0/G1期的細(xì)胞數(shù)目比例從62.61±4.3％增加到78.94±3.91％而與之相反S期的細(xì)胞比例從30.14±5.49％下降到12.31±5.09％。進(jìn)一步通過BrdU試驗(yàn)觀察ClC-3沉默后對(duì)DNA摻入的影響，同等滲對(duì)照組相

16、比，基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BrdU摻入率在低滲培養(yǎng)處理組、低滲+negativesiRNA處理組、低滲+ClC-3siRNA處理組分別增加。 2.低滲對(duì)細(xì)胞容積的影響以及ClC-3的作用 通過檢測(cè)細(xì)胞的電容來(lái)觀察細(xì)胞的容積變化在細(xì)胞增殖中的作用，結(jié)果表明：等滲對(duì)照組的電容為37.28±1.31pF，低滲處理可使細(xì)胞容積增加，膜電容增加到48.56±2.08pF，沉默ClC-3后低滲能誘導(dǎo)細(xì)胞電容增加到40.44±2.52pF

17、，但是增加幅度遠(yuǎn)較未沉默組小。 3.低滲對(duì)增殖相關(guān)信號(hào)通路的影響以及ClC-3在這個(gè)過程中的作用 為了進(jìn)一步觀察沉默ClC-3表達(dá)的作用，我們檢查與細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換點(diǎn)相關(guān)的信號(hào)通路，結(jié)果表明同對(duì)照組相比，低滲處理1小時(shí)能引起基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ERK1/2磷酸化，當(dāng)ClC-3表達(dá)被沉默后，低滲誘導(dǎo)ERK1/2的磷酸化程度明顯比未沉默組減弱。 1)低滲直接激活VRCC誘導(dǎo)大鼠基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖且促進(jìn)細(xì)胞周期從