Tim-3對Th1-Th2細(xì)胞平衡的調(diào)控在支氣管哮喘中的作用.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分、Tim-3對Th1/Th2細(xì)胞平衡的調(diào)控在支氣管哮喘小鼠中的作用
　　 分題1：支氣管哮喘小鼠外周血CD4+T淋巴細(xì)胞Tim-3表達(dá)的研究及其與Thl/Th2細(xì)胞因子的關(guān)系
　　 目的：檢測支氣管哮喘小鼠外周血淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞免疫球蛋白與黏蛋白域蛋白3(T cell Ig and mucin domain-containing molecule-3，Tim-3)的表達(dá)及與Th1

2、/Th2細(xì)胞因子之間的關(guān)系,探討其在哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法：建立小鼠哮喘動物模型，分為三組，正常對照組、哮喘1天組和哮喘7天組，每組8只。收集各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction RT-PCR）檢測外周血淋巴細(xì)胞Tim-3mRNA的水平，流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測CD4+T淋巴細(xì)胞中Tim-3+的細(xì)胞比例（CD4+T

3、im-3+/CD4+）反映Tim-3蛋白的水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）檢測淋巴細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素4 (Interleukin-4，IL-4)、干擾素γ（Interferon-γ,IFN-γ）的水平，并分析Tim-3的表達(dá)與IL-4，IFN-γ水平的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：哮喘1天組和哮喘7天組外周血淋巴細(xì)胞中Tim-3mRNA的水平和CD4+Tim-3

4、+/CD4+顯著高于正常對照組(P值均＜0.01),哮喘7天組顯著高于哮喘1天組(P＜0.05)；哮喘1天組和哮喘7天組外周血淋巴細(xì)胞上清液中IL-4的水平顯著高于正常對照組(P值均＜0.05)，哮喘7天組顯著高于哮喘1天組（P＜0.05）；哮喘1天組和哮喘7天組外周血淋巴細(xì)胞上清液中IFN-γ的水平顯著低于正常對照組（P值均＜0.05），哮喘7天組顯著低于哮喘1天組（P＜0.05）；哮喘7天組外周血淋巴細(xì)胞IL-4的水平分別與Tim-

5、3mRNA的表達(dá)和CD4+Tim-3+/CD4+呈正相關(guān)（r=0.78，r=0.81 P值均＜0.05）,IFN-γ的水平分別與Tim-3mRNA的表達(dá)和CD4+Tim-3+/CD4+呈負(fù)相關(guān)（r=-0.82，r=-0.89 P值均＜0.05）。
　　 結(jié)論：支氣管哮喘小鼠外周血淋巴細(xì)胞中Tim-3mRNA和蛋白的水平均顯著高于正常對照組，而且哮喘7天組顯著高于哮喘1天組；同時Tim-3的表達(dá)與IL-4的水平呈高度正相關(guān)，與IF

6、N-γ的水平呈高度負(fù)相關(guān)，提示Tim-3可能在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用并且與Th1/Th2失衡密切相關(guān)。
　　 分題2：支氣管哮喘小鼠氣道T淋巴細(xì)胞中Tim-3表達(dá)的研究
　　 目的：檢測支氣管哮喘小鼠氣道T淋巴細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)及IL-4、IFN-γ的分泌情況，探討它們在哮喘免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法：將24只昆明小鼠隨機(jī)分成三組，正常對照組、哮喘1天組和哮喘7天組，每組8只。收集各組小鼠

7、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），使用Wright-Giemsa染色法分類計數(shù)肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophile，EOS）計數(shù)，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測肺泡灌洗液炎性細(xì)胞中Tim-3mRNA的水平，流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測CD4+T淋巴細(xì)胞中Tim3+細(xì)胞的比例，用CD4+Tim-3+/CD4+代表Tim-3蛋白的水平，ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液炎性細(xì)胞上清液中IL

8、-4，IFN-γ的水平，并分析EOS的表達(dá)與Tim-3，IL-4，IFN-γ水平的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：哮喘7天組肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)、EOS計數(shù)及上清液中IL-4含量均顯著高于哮喘1天組和正常對照組，并且哮喘1天組高于正常對照組；哮喘7天組肺泡灌洗液中IFN-γ含量均顯著低于哮喘1天組和正常對照組，并且哮喘1天組低于正常對照組；哮喘1天組和哮喘7天組肺泡灌洗液細(xì)胞中Tim-3mRNA的水平和CD4+Tim-3+/CD4+顯著

9、高于正常對照組,哮喘7天組顯著高于哮喘1天組；哮喘7天組肺泡灌洗液細(xì)胞中EOS計數(shù)分別與Tim-3mRNA、CD4+Tim-3+/CD4+及上清液中IL-4的水平呈正相關(guān)，與IFN-γ的水平呈負(fù)相關(guān)；哮喘7天組肺泡灌洗液炎性細(xì)胞中Tim-3mRNA和CD4+Tim-3+/CD4+分別與上清液中IL-4的水平呈正相關(guān)，與IFN-γ的水平呈負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論：哮喘小鼠肺泡灌洗液炎性細(xì)胞中Tim-3mRNA和蛋白的水平均顯著高于正常

10、對照組，提示Tim-3在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起了一定的作用；在哮喘7天組的小鼠肺泡灌洗液炎性細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)均顯著高于哮喘1天組,提示Tim-3在哮喘的持續(xù)發(fā)作中可能也起了一定的作用。另外，肺泡灌洗液炎性細(xì)胞中EOS計數(shù)與Tim-3mRNA和CD4+Tim-3+/CD4+的水平呈正相關(guān)，這提示Tim-3和哮喘小鼠氣道EOS性炎癥可能有一定的聯(lián)系；Tim-3的高表達(dá)與與IFN-γ的水平呈負(fù)相關(guān)，提示Tim-3可能與支氣管哮喘中Th1/T

11、h2細(xì)胞失衡有關(guān)。
　　 分題3：Tim-3中和抗體對哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞功能的影響
　　 目的：了解Tim-3中和抗體對哮喘小鼠外周血及肺泡灌洗液中T淋巴細(xì)胞體外增殖功能和細(xì)胞因子合成功能的影響情況，探討其治療哮喘的可能機(jī)制。
　　 方法：將16只昆明小鼠隨機(jī)分成2組，分別采集外周血和肺泡灌洗液，并分離出T淋巴細(xì)胞，體外分組培養(yǎng)，干預(yù)組以不同濃度干預(yù)不同時間。用四甲基偶氮唑鹽(3-(4,5-dimethyl-2-

12、thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)分別測定各組T淋巴細(xì)胞的增殖情況，用ELISA法測定T淋巴細(xì)胞上清液中IL-4、IFN-γ的水平。
　　 結(jié)果：與空白組比較，Tim-3中和抗體對體外培養(yǎng)的哮喘和正常小鼠外周血和BALF中T淋巴細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用，其抑制率隨著中和抗體劑量的增加和時間的延長而增強(qiáng)；但是對哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于正常小鼠；同時哮喘小

13、鼠抗體干預(yù)組T淋巴細(xì)胞IL-4的表達(dá)水平較空白組明顯下降，IFN-γ的水平明顯增加。
　　 結(jié)論：Tim-3中和抗體能抑制哮喘小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖和IL-4的合成，增加IFN-γ的分泌。Tim-3可能作為哮喘治療新的分子靶點。
　　 第二部分、Tim-3對Th1/Th2細(xì)胞平衡的調(diào)控在支氣管哮喘患者中的作用
　　 分題1：外周血淋巴細(xì)胞Tim-3 mRNA的表達(dá)與哮喘發(fā)病及肺功能相關(guān)性的研究
　　 目的：

14、檢測哮喘患者外周血淋巴細(xì)胞中Tim-3mRNA的表達(dá)，并分析其與上清液中IL-4，IFN-γ的水平和肺功能的相關(guān)性，探討Tim-3mRNA在哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法：收集哮喘患者44例，其中緩解期21例，輕至中度急性發(fā)作期23例，另選17名健康者作為對照，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞中Tim-3mRNA的表達(dá)并做半定量分析，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測淋巴細(xì)胞上清液中IL-4，IFN-γ的水平，并測定所有

15、受試者的肺功能，分析Tim-3mRNA與IL-4，IFN-γ的水平和肺功能的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：哮喘發(fā)作期外周血淋巴細(xì)胞中Tim-3mRNA及IL-4的水平明顯升高，與緩解期和健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，緩解期較健康對照組升高明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；哮喘發(fā)作期外周血淋巴細(xì)胞上清液中IFN-γ的水平較緩解期和健康對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，緩解期也低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。哮喘發(fā)作期外周血淋巴細(xì)胞中Tim-3

16、mRNA的表達(dá)水平與IL-4呈正相關(guān)，與IFN-γ和肺功能分別呈負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論：Tim-3mRNA的表達(dá)在哮喘患者外周血淋巴細(xì)胞中是明顯高于正常人群，且在哮喘發(fā)作期高于緩解期，提示Tim-3可能參與哮喘的發(fā)生與發(fā)展。哮喘患者無論是在哮喘發(fā)作期還是在哮喘緩解期外周血淋巴細(xì)胞Tim-3mRNA表達(dá)與第一秒用力呼氣量、1秒率FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)，提示Tim-3有可能作為間接反映哮喘氣道阻塞及病情嚴(yán)重程度的一個指標(biāo)。
　

17、　 分題2：哮喘患者誘導(dǎo)痰中Tim-3mRNA表達(dá)的研究
　　 目的：了解哮喘患者誘導(dǎo)痰炎性細(xì)胞中Tim-3mRNA的表達(dá)及IL-4，IFN-γ的分泌情況，并探討其與肺功能的相關(guān)性，分析它們與氣道炎癥的關(guān)系。
　　 方法：53例哮喘患者，其中緩解期25例，輕至中度急性發(fā)作期28例，另選19名健康者作為對照，采用Wright-Giemsa染色法對誘導(dǎo)痰中炎性細(xì)胞進(jìn)行分類計數(shù)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測Tim-3mRNA

18、在誘導(dǎo)痰炎性細(xì)胞中的表達(dá)，ELISA法測定誘導(dǎo)痰上清液中IL-4，IFN-γ的含量，并測定所有受試者的肺功能。
　　 結(jié)論：支氣管哮喘患者誘導(dǎo)痰炎性細(xì)胞中Tim-3mRNA的表達(dá)明顯高于健康對照者，且急性發(fā)作期高于緩解期，提示Tim-3可能參與哮喘的發(fā)生與發(fā)展；哮喘患者氣道炎性細(xì)胞中Tim-3mRNA的表達(dá)與EOS計數(shù)和IL-4的水平呈正相關(guān)，與IFN-γ呈負(fù)相關(guān)，因此檢測誘導(dǎo)痰炎性細(xì)胞中Tim-3mRNA的表達(dá)不僅可以從分子水