Th17細(xì)胞亞群在支氣管哮喘中的發(fā)病機(jī)制及TLR2對(duì)Th17細(xì)胞分化的調(diào)控研究.pdf

1、第一部分 Th17和Tc17細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子白介素17在哮喘小鼠動(dòng)物模型中的表達(dá)研究
　　 目的:探討輔助性T細(xì)胞17（Th17）和CD8+IL-17+細(xì)胞（Tc17）在支氣管哮喘小鼠中的比例變化及其意義。
　　 方法:24只BABL/c 小鼠隨機(jī)分成兩組：哮喘組和正常對(duì)照組，每組12只，用卵蛋白（OVA）致敏和激發(fā)的方法建立小鼠哮喘模型。然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟單個(gè)核細(xì)胞中Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞所占的百分比；用

2、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞因子IL-17的水平；雙標(biāo)免疫熒光檢測(cè)肺組織中Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞的表達(dá)。
　　 結(jié)果:哮喘組肺組織炎癥改變明顯；哮喘組脾臟細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，Tc17細(xì)胞比例也顯著高于對(duì)照組；哮喘組BALF中IL-17 水平顯著高于正常對(duì)照組；哮喘組BAL中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目明顯高于對(duì)照組)；肺組織免疫熒光結(jié)果示Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞在哮喘小鼠的肺部有

3、表達(dá)，主要分布在支氣管周圍和血管周圍，并且數(shù)量明顯高于對(duì)照組。
　　 結(jié)論:哮喘小鼠的Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞數(shù)量增多，并且分泌的細(xì)胞因子IL-17水平升高，而且哮喘小鼠肺部有較多的Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞浸潤(rùn)，提示Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞可能參與了哮喘的發(fā)病機(jī)制。
　　 第二部分 Toll 樣受體2 信號(hào)對(duì)小鼠淋巴瘤EL4細(xì)胞系表達(dá)白細(xì)胞介素（IL）-17 影響的研究
　　 目的:探討TLR2 信號(hào)通路對(duì)

4、小鼠淋巴瘤細(xì)胞系EL4細(xì)胞表達(dá)分泌IL-17A的影響。
　　 方法:用ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-17A表達(dá)水平，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中RORγt和IL-17A的mRNA的表達(dá)水平變化。
　　 結(jié)果:TLR2 配體可以顯著增加細(xì)胞IL-17A和RORγt和IL-17A的mRNA的表達(dá)，而TLR2 抗體可以將這種促進(jìn)作用抵消一部分，TLR2 配體刺激后細(xì)胞上清中IL-17A蛋白水平也明顯升高。

5、
　　 結(jié)論：Toll 樣受體2 信號(hào)對(duì)小鼠淋巴瘤EL4細(xì)胞系表達(dá)IL-17是起促進(jìn)作用的，這種作用可能是通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子 RORγt的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 第三部分 Toll 樣受體2 信號(hào)激活對(duì)Th17細(xì)胞分化和功能的影響研究
　　 目的:探討Toll 樣受體2 信號(hào)在調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的分化和功能方面的作用，并且初步探討參與調(diào)控的信號(hào)通路機(jī)制。
　　 方法:制作小鼠哮喘模型，免疫磁珠分選CD4+T細(xì)胞

6、經(jīng)體外誘導(dǎo)分化成Th17細(xì)胞，細(xì)胞分為四組：（1）空白對(duì)照組，（2）用TLR2的配體（LTA）激活TLR2 信號(hào)組，（3）TLR2的抗體阻斷TLR2 信號(hào)組，（4）RORc基因的干擾慢病毒組。然后MTT 法檢測(cè)各組的細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組胞內(nèi)因子IL-17A的水平，ELISA 檢測(cè)各組的細(xì)胞上清液中的IL-17A 蛋白水平，Real-time RT-PCR檢測(cè)各組的Th17 相關(guān)細(xì)胞因子（IL-17A、IL-17F和IL-22

7、）的mRNA 水平，并檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子RORγt的mRNA水平的變化。
　　 結(jié)果:
　　 （1）MTT 檢測(cè)結(jié)果示，LTA、LTA+TLR2 抗體和LTA+慢病毒都能增加Th17細(xì)胞的增殖，與空白對(duì)照組比較，P 值的大小分別為P＜0.05，P＜0.001和 P＜0.01。
　　 （2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明慢病毒感染細(xì)胞后可使RORc的mRNA 水平下降86％，各組的Th17 相關(guān)基因mRNA 水平檢測(cè)，LTA

8、組引起IL-17A、IL-17F和IL-22的mRNA 水平明顯升高，LTA+TLR2 抗體組和LTA+慢病毒組上述升高效應(yīng)又被逆轉(zhuǎn)。
　　 （3）蛋白水平檢測(cè)胞內(nèi)因子染色流式分析LTA 可以明顯刺激增加IL-17A+細(xì)胞的百分比，IL-17A+CD8-％由11.7％增加到22.5％。ELISA 檢測(cè)細(xì)胞上清中的IL-17A 結(jié)果為L(zhǎng)TA組引起IL-17A 蛋白水平增高，而LTA+TLR2 抗體組和LTA+慢病毒組蛋白水平又下降

9、。
　　 （4）TLR2 信號(hào)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA 水平的影響：LTA組的RORγt mRNA 水平明顯增高。
　　 結(jié)論:TLR2 信號(hào)能促進(jìn)Th17細(xì)胞的增殖，能增強(qiáng)Th17細(xì)胞的功能，并且是通過(guò)增加特異性的轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 第四部分支氣管哮喘患者的血漿IL-21和總IgE 水平及其相關(guān)性研究
　　 目的:探討白介素-21（IL-21）和總IgE在支氣管哮喘發(fā)病時(shí)的血

10、清水平及其兩者相關(guān)性。
　　 方法:隨機(jī)收集哮喘急性發(fā)作期患者38例（急性發(fā)作組），哮喘緩解期患者23例（緩解組）和健康者19例（對(duì)照組）血清，用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清IL-21和總IgE 水平。
　　 結(jié)果:哮喘急性發(fā)作期患者血清IL-21 水平明顯高于正常對(duì)照組，急性發(fā)作期IL-21 明顯高于緩解期組，而緩解期和正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清總IgE 水平哮喘急性發(fā)作期和緩解期均明顯高于正常對(duì)照組。哮喘