Il-17-Th17及Th1-Th2在兒童哮喘中的作用研究.pdf

1、一.研究背景:
　　 支氣管哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞共同參與，以氣流受限、氣道重塑為特征的氣道炎癥性疾病，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)，每年因哮喘而死亡的病人數(shù)高達(dá)10萬人，造成巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)。支氣管哮喘哮喘的防治已成為當(dāng)今世界共同關(guān)注的公共健康問題。
　　 Th細(xì)胞在哮喘的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。既往的研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2失衡是哮喘的基本病理生理表現(xiàn)，Th

2、2細(xì)胞釋放炎癥因子產(chǎn)生IL-4，IL-5，IL-9和IL-13等細(xì)胞因子，引發(fā)過敏性炎癥及Th2-相關(guān)組織損傷，最終導(dǎo)致哮喘的發(fā)病。IL-4，具有代表性的Th2類細(xì)胞因子，能促進(jìn)B細(xì)胞的增殖、分化，抑制其凋亡，誘導(dǎo)IgG或IgM向IgE的轉(zhuǎn)化及多種炎性趨化因子的生成，加強(qiáng)局部嗜酸性粒細(xì)胞、Th2淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及嗜堿粒細(xì)胞的募集，啟動(dòng)并維持氣道炎癥反應(yīng)，引起哮喘的發(fā)作。同時(shí)，也可以通過刺激杯狀細(xì)胞及纖維母細(xì)胞參與哮喘氣道的粘液高分泌與

3、氣道重塑。Th1細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2、LT-α、TNF-β等細(xì)胞因子，促進(jìn)吞噬細(xì)胞的活化及調(diào)理素、補(bǔ)體的產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體的清除發(fā)揮防御作用。IFN-γ作為Th1細(xì)胞代表性細(xì)胞因子，能促進(jìn)天然T細(xì)胞向Th1的分化，抑制Th2細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)嗜酸粒細(xì)胞的募集和活化，減少局部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而維持Th1/Th2細(xì)胞的平衡，對(duì)哮喘的發(fā)病起保護(hù)作用。隨著對(duì)哮喘研究的不斷深入，這一理論并不能完全解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制。
　　 近年來

4、，區(qū)別于Th1、Th2的新型T淋巴細(xì)胞亞群Th17的發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充了這一理論。Th17特異產(chǎn)生的IL-17，可激活支氣管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，分泌IL-6、IL-8、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor，G-CSF)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、粘附分子（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）等炎

5、癥因子;誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在局部的募集和活化，上調(diào)Th2細(xì)胞調(diào)控的嗜酸粒細(xì)胞炎癥，與氣道炎癥和氣道高反應(yīng)(airway hyperresponsiveness，AHR)密切相關(guān)。尤其，在非特異性、非IgE依賴、非嗜酸粒細(xì)胞炎癥的哮喘中發(fā)揮重要作用。研究表明，IL-17促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞粘蛋白5B(mucin5B，MUC5B)和粘蛋白5A(MUC5A)的表達(dá)，引起哮喘氣道粘液的過度分泌。IL-17還可通過啟動(dòng)一系列炎性反應(yīng)，造成肺組織破壞、氣道

6、平滑肌痙攣、氣道上皮細(xì)胞損傷、上皮下纖維化等不良后果。因此，Th1/Th2細(xì)胞、IL-17/Th17可能共同參與了哮喘的發(fā)病機(jī)制，各T細(xì)胞亞群之間的平衡及其相互作用可能在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了一定作用。
　　 IL-17家族包括六個(gè)成員，分別為IL-17A，IL-17B，IL-17C，IL-17D，IL-17E，以及IL-17F.IL-17A有著極其廣泛的生物學(xué)作用，可能通過誘導(dǎo)炎癥調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生參與包括支氣管哮喘在內(nèi)的多種免疫

7、及炎癥反應(yīng)。IL-17F與IL-17A有很大程度的同源性，其生物學(xué)功能也很相似。IL-17F可誘導(dǎo)IL-6、IL-8、TGF-β及ICAM-1等細(xì)胞因子，間接促進(jìn)中性粒細(xì)胞在氣道的募集，影響氣道炎癥。既往研究發(fā)現(xiàn)哮喘病人經(jīng)過敏原刺激后IL-17F基因表達(dá)上調(diào)，IL-17F能增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)的過敏性炎癥反應(yīng)，可能與哮喘的易感性存在相關(guān)性。
　　 遺傳及環(huán)境因素在哮喘中發(fā)揮著重要作用，隨著遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，有關(guān)哮喘遺傳易感性的研究引起了

8、人們廣泛的興趣。目前據(jù)報(bào)道有超過100個(gè)哮喘相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，如Toll樣受體2(TLR2)、IL-4RA、STAT6、絲聚蛋白(FLG)、TNF、白三烯C4合酶(LTC4S)、PTEN基因等。
　　 IL-17F基因長(zhǎng)度為7742bp，包含3個(gè)外顯子，位于6號(hào)染色體長(zhǎng)臂。研究發(fā)現(xiàn)此區(qū)域與哮喘及其表型相關(guān)。IL-17F SNP rs763780位于3號(hào)外顯子，該位點(diǎn)7488T/C堿基突變，使I7F第161位氨基酸由組氨酸(His)

9、變?yōu)榫彼?Arg)，蛋白質(zhì)的改變導(dǎo)致IL-17F促進(jìn)靶細(xì)胞分泌促炎因子的能力低下。作為一個(gè)功能位點(diǎn)，IL-17F His161Arg基因多態(tài)性已應(yīng)用于多種疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)研究。IL-17F His161Arg被認(rèn)為與炎性腸道疾病(inflammatory bowel disease，IBD)、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)、白塞氏病、胃癌、慢性疲勞綜合征(chronicfatigue syndrome，C

10、FS)等疾病有關(guān)。
　　 近年來，IL-17F基因多態(tài)性rs763780與哮喘的關(guān)聯(lián)性也引起了一些學(xué)者的關(guān)注。最新研究顯示在日本人群中rs763780(H161R)基因多態(tài)性(TC/CC)與哮喘的發(fā)病相關(guān)，且體外功能實(shí)驗(yàn)揭示了IL-17F第3外顯子上組氨酸突變?yōu)榫彼?，突變的IL-17F純合子(CC)影響IL-17F與受體的結(jié)合力，還通過以下途徑造成其功能的缺失:不能磷酸化ERK1/2，阻斷了Raf-1—MAPK1/2—ERK1

11、/2信號(hào)傳導(dǎo)通路;不能誘導(dǎo)支氣管上皮產(chǎn)生細(xì)胞因子及趨化因子，包括IL-8、IL-6及GM-CSF等的表達(dá);不能像野生型有效地增強(qiáng)嗜酸粒細(xì)胞性過敏反應(yīng)及氣道重塑進(jìn)程，因此降低了哮喘發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。Ramsey CD等研究非裔和歐裔美國(guó)女性IL-17F基因分型，分析包括rs763780在內(nèi)的50個(gè)SNPs未發(fā)現(xiàn)與哮喘相關(guān)。韓國(guó)學(xué)者Eun-Heui Jin等人分析了IL-17F基因多態(tài)性，結(jié)果顯示啟動(dòng)序列rs1889570基因多態(tài)性與哮喘易感性有

12、關(guān)，rs763780基因分型及等位基因在哮喘與健康人群中無差異。哮喘是一種復(fù)雜的多因素參與的疾病，上述結(jié)果存在一定的差異，原因可能為基因的異質(zhì)性及環(huán)境等因素的不同。不同人群中SNP的分布頻率不同，在Ramsey CD的研究中H161R在歐裔美國(guó)人的突變率為4.5％，遠(yuǎn)低于日本人(11.4％)。同時(shí)哮喘是一種復(fù)雜的，多基因遺傳傾向的疾病，基因與基因之間有著相互作用及累積效應(yīng)，從而使得遺傳因素存在差異。哮喘的易感性還與環(huán)境因素有關(guān)，如吸煙（

13、被動(dòng)或主動(dòng)）、空氣中粉塵、寵物、職業(yè)暴露等等。這些均可造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于rs763780(H161R)基因突變與支氣管哮喘的相關(guān)性研究報(bào)道較少。
　　 二.研究目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)哮喘患者血清中各T細(xì)胞亞群代表性細(xì)胞因子的檢測(cè)，擬探討IL-17/Th17、Th1/Th2在哮喘發(fā)病中的作用，分析哮喘的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，同時(shí)初步研究IL-17F基因多態(tài)性與兒童支氣管哮喘的關(guān)聯(lián)性，為哮喘的免疫學(xué)治療方法及其

14、遺傳易感性的篩選提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 三.材料與方法:
　　 1、研究對(duì)象及分組
　　 (1)2011年3月-2012年10月于本院門診隨診的60例哮喘患兒（臨床緩解期），男38例，女22例，年齡2-15歲，平均5.3歲。均符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)會(huì)呼吸學(xué)組制定的兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)，入組前一周均無使用激素及急性感染病史。
　　 (2)對(duì)照組:2012年3月到2012年10月于本院健康

15、體檢兒童60例，男36例，女24例;年齡2-14歲，平均5.2歲。均無過敏性疾病病史，入組前一周均無使用激素及急性感染病史。
　　 (3)兩組兒童組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，家長(zhǎng)均知情同意參加該項(xiàng)研究。
　　 2、標(biāo)本采集
　　 兩組兒童均于清晨空腹留取外周靜脈血3ml，其中1ml，于室溫(20～25℃)放置60min，2000r/min離心10min，制備血清，-70℃冰箱凍存?zhèn)錂z。另外2ml，提取全基因

16、組DNA，-20℃冰箱凍存?zhèn)錂z。
　　 1.3采用ELISA方法測(cè)定血清IL-4、IL-17、IFN-γ細(xì)胞因子水平。
　　 3、細(xì)胞因子IL-4、IL-17、IFN-γ的測(cè)定
　　 3.1采用ELISA方法測(cè)定血清IL-4、IL-17、IFN-γ細(xì)胞因子水平。所有的檢測(cè)步驟均嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，包括加樣、封板、水浴、洗板、加酶、顯色、讀取OD值等操作。
　　 4、IL-17F基因序列rs763780(H1

17、61R)基因多態(tài)性檢測(cè)
　　 4.1應(yīng)用DNA測(cè)序法檢測(cè)rs763780(H161R)基因多態(tài)性
　　 (1)采用苯酚/氯仿提取法提取全基因組DNA。
　　 (2)設(shè)計(jì)引物。
　　 (3)PCR擴(kuò)增目的基因。
　　 (4)基因測(cè)序及分析
　　 3、數(shù)據(jù)分析
　　 計(jì)量資料采用x2檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)。用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， P＜0.05作為差異有顯著意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。<

18、br>　　 四.結(jié)果:
　　 1、血清細(xì)胞因子IL-4、IL-17和IFN-γ水平檢測(cè)結(jié)果
　　 哮喘兒童與正常對(duì)照組比較，IL-4水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=45.97 P＜0.05)。
　　 哮喘兒童與正常對(duì)照組比較，IL-17水平高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.08 P＜0.01)。
　　 哮喘兒童與正常對(duì)照組比較，IFN-γ水平低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.

19、06 P＜0.001)。
　　 2.IL-17F基因序列rs763780(H161R)基因型在兩組內(nèi)均未檢測(cè)到突變型CC。rs763780(H161R)基因型(TC/TT)在兩組間內(nèi)的分布有明顯的差異(x2=5.71, P=0.017＜0.05)。
　　 3.TC基因型哮喘患兒與正常對(duì)照組比較，IL-4水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=22.69P＞0.05); IL-17水平無明顯差異(t=3.79 P＞0.05);干擾素水平低于

20、正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.92 P＜0.01)。
　　 TT基因型的哮喘組與正常對(duì)照組比較，血清IL-4水平在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=38.43 P＞0.05); IFN-γ水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=14.26 P＞0.05); IL-17水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=3.77 P＞0.05)。
　　 不同基因型(TT/TC)哮喘患兒組血清中IL-4水平無明顯差異(t=0.38P＞0.05)。
　　 不同基因型

21、(TT/TC)哮喘患兒血清中IL-17水平無明顯差異(t=1.58P＞0.05)。
　　 不同基因型(TT/TC)哮喘患兒血清中IFN-γ水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯差異(t=0.93P＜0.05)。
　　 4.TC基因型OR和95％可信區(qū)間(CI)為2.09(1.12-3.90)，TT基因型OR和95％CI為0.76(0.60-0.95)。
　　 五.結(jié)論:
　　 本課題采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、基因測(cè)序等方法，研究了

22、IL-4、IL-17、IFN-γ在哮喘發(fā)病中的作用以及IL-17F基因多態(tài)性與哮喘的相關(guān)性研究。通過研究我們得到以下結(jié)論:
　　 1、T細(xì)胞亞群的平衡與哮喘相關(guān)。哮喘患兒血清中IL-4、IL-17表達(dá)升高，IFN-γ分泌下降，提示我們哮喘患兒存在Th1細(xì)胞功能不足及Th2細(xì)胞功能亢進(jìn)，IL-17/Th17可能在哮喘發(fā)病中發(fā)揮作用。
　　 2、IL-17F基因多態(tài)性rs763780(H161R)基因型分布(TC/TT)在兩