含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒的研制及其應(yīng)用研究.pdf

1、風(fēng)疹病毒是常見的上呼吸道感染病原體，也是常見的胎兒致畸的主要病原之一。風(fēng)疹病毒主要侵犯上呼吸道粘膜，引起上呼吸道炎癥。風(fēng)疹病毒感染最嚴(yán)重的問題是孕婦感染可導(dǎo)致對(duì)嬰兒的先天性損害，尤其前3個(gè)月感染風(fēng)疹病毒，可通過胎盤感染胎兒，導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)、死胎，或新生兒一系列的器官畸形等先天性風(fēng)疹綜合癥。 目前，風(fēng)疹病毒實(shí)驗(yàn)室診斷越來越多地采用核酸擴(kuò)增方法來檢測(cè)臨床標(biāo)本中的風(fēng)疹病毒RNA。但是，目前使用的以RT-PCR為主的RNA病毒核酸擴(kuò)增檢測(cè)

2、試劑盒中，一般采用風(fēng)疹病毒顆粒、裸露RNA或病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA作為陽性質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)品。病毒顆粒和裸露RNA具有潛在的生物傳染性，不穩(wěn)定，易被RNase降解；cDNA不在病毒顆粒內(nèi)，無法模擬臨床標(biāo)本中病毒核酸的提取及RNA逆轉(zhuǎn)錄過程，所以，風(fēng)疹病毒顆粒、裸露RNA或病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品或質(zhì)控品，準(zhǔn)確性都不理想。因而，人們普遍關(guān)心的是病毒核酸檢測(cè)試劑盒中使用的陽性參考品和質(zhì)控品是否具有傳染性以及能否起到陽性全程監(jiān)控的

3、作用。提出假設(shè)：利用MS2噬菌體衣殼蛋白自我組裝的特性，采用原核表達(dá)技術(shù)將風(fēng)疹病毒E1部分保守序列包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內(nèi)構(gòu)成噬菌體樣顆粒，組裝成內(nèi)含風(fēng)疹病毒El部分保守序列耐RNase的噬菌體樣顆粒，并將其作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用于風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法中，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1.建立風(fēng)疹病毒RNA TaqmMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。 2.利用MS2噬菌體衣殼

4、蛋白自我組裝的特性，采用原核表達(dá)技術(shù)將風(fēng)疹病毒E1部分保守序列包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內(nèi)構(gòu)成噬菌體樣顆粒，組裝成內(nèi)含風(fēng)疹病毒E1部分保守序列耐RNase的噬菌體樣顆粒。 3.將構(gòu)建的風(fēng)疹病毒RNA噬菌體樣顆粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用于所建立的風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法中，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。 實(shí)驗(yàn)第一部分： 建立風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，將風(fēng)疹病毒RNA逆轉(zhuǎn)

5、錄cDNA作為RV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品，定量檢測(cè)已確診的風(fēng)疹患者咽拭子標(biāo)本中風(fēng)疹病毒RNA，評(píng)價(jià)其敏感度與特異度。 實(shí)驗(yàn)第二部分： 利用MS2噬菌體衣殼蛋白自我組裝的特性，采用原核表達(dá)技術(shù)將風(fēng)疹病毒E1部分保守序列包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內(nèi)構(gòu)成噬菌體樣顆粒。即將大腸桿菌MS2噬菌體衣殼蛋白的編碼基因序列構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET30a（+）獲一重組表達(dá)載體，然后將風(fēng)疹病毒E1的部分高度保守RNA序列構(gòu)建到該

6、重組表達(dá)載體上，經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)獲內(nèi)含風(fēng)疹病毒E1部分保守序列的噬菌體樣顆粒，然后對(duì)內(nèi)含風(fēng)疹病毒E1部分保守序列的噬菌體樣顆粒進(jìn)行定量分析，并驗(yàn)證其耐核糖核酸酶（RNase）特性，以及分析其在4℃和37℃血漿中的穩(wěn)定性，并與風(fēng)疹病毒病毒株在37℃血漿中的穩(wěn)定性進(jìn)行比較。 實(shí)驗(yàn)第三部分： 將實(shí)驗(yàn)第二部分構(gòu)建的內(nèi)含風(fēng)疹病毒E1部分保守序列的噬菌體樣顆粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)第一部分所建立的風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定

7、量RT-PCR方法中，并定量檢測(cè)已確診的風(fēng)疹患者鼻咽拭子標(biāo)本中風(fēng)疹病毒RNA，評(píng)價(jià)其敏感度與特異度。通過對(duì)其檢測(cè)靈敏度、重復(fù)性、敏感度與特異度等指標(biāo)的測(cè)定，并與實(shí)驗(yàn)第一部分中RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行比較，來分析實(shí)驗(yàn)第二部分構(gòu)建的內(nèi)含風(fēng)疹病毒E1部分保守序列的噬菌體樣顆粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品的優(yōu)勢(shì)所在。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.建立風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，將風(fēng)疹病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄

8、的cDNA，作為RV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品，定量檢測(cè)已確診的風(fēng)疹患者鼻咽拭子標(biāo)本中風(fēng)疹病毒RNA，評(píng)價(jià)其敏感度與特異度。 2.利用MS2噬菌體衣殼蛋白自我組裝的特性，采用原核表達(dá)技術(shù)將風(fēng)疹病毒E1部分保守序列包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內(nèi)構(gòu)成噬菌體樣顆粒，采用基因工程方法構(gòu)建含部分RV E1、MS2衣殼蛋白及裝配蛋白編碼基因重組表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒。 3.行RT-

9、PCR及PCR對(duì)噬菌體樣顆粒包繞的內(nèi)容物風(fēng)疹病毒RNA進(jìn)行驗(yàn)證。 4.采用風(fēng)疹病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法對(duì)含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒進(jìn)行定量分析。 5.將噬菌體樣顆粒懸浮液用TSM稀釋液分別稀釋107、108、109倍，對(duì)含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒每一個(gè)濃度實(shí)施RNase處理，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法定量檢測(cè)RNase處理前后的含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒，通過比較RNase處理

10、前后的Ct值有沒有顯著性差別，來驗(yàn)證含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒耐核糖核酸酶（RNase）特性。 6.將噬菌體樣顆粒懸浮液，置于4℃和37℃EDTA抗凝正常人血漿中，分別孵育60天和30天，來驗(yàn)證含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒在4℃及37℃血漿中的穩(wěn)定性；將含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液與RV病毒株，分別置于37℃EDTA抗凝正常人血漿中，孵育30天，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法定量測(cè)定收集的幾個(gè)時(shí)

11、間點(diǎn)的噬菌體樣顆粒懸浮液與RV病毒株濃度，來比較噬菌體樣顆粒與RV病毒株在37℃血漿中的穩(wěn)定性。 7.將含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒作為RV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定其檢測(cè)靈敏度及方法的重復(fù)性，并定量檢測(cè)已確診的風(fēng)疹患者鼻咽拭子標(biāo)本中風(fēng)疹病毒RNA，確定其敏感度與特異度。 8.將含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒作為實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)PCR擴(kuò)增效率、方法的檢測(cè)靈敏度、重復(fù)性、方法

12、的敏感度與特異度，與風(fēng)疹病毒逆轉(zhuǎn)錄cDNA作為實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的PCR擴(kuò)增效率、方法的檢測(cè)靈敏度、重復(fù)性、方法的敏感度與特異度進(jìn)行比較。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.成功建立了風(fēng)疹病毒RNA TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，采用風(fēng)疹病毒逆轉(zhuǎn)錄cDNA作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，PCR擴(kuò)增效率為1.89，方法的檢測(cè)靈敏度為1.0×103copies/ml，方法的重復(fù)性結(jié)果為：對(duì)六個(gè)稀釋度陽性標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)六次Ct值變異系

13、數(shù)范圍為3.29％～4.36％。以細(xì)胞培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，方法的特異度和敏感度分別為88.9％，81.3％。 2.通過部分風(fēng)疹病毒E1保守序列測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建與表達(dá)含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒。 3.將含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液進(jìn)行104，105，106，107倍稀釋，然后以各個(gè)稀釋度為模板，分別行RT-PCR及PCR。RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性，PCR擴(kuò)增結(jié)果為陰性，表明噬菌體樣顆粒包繞的內(nèi)容物

14、為風(fēng)疹病毒RNA，不是DNA，也不是DNA污染。 4.將含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液進(jìn)行104，105，106倍稀釋，然后分別以各個(gè)稀釋度為模板，采用風(fēng)疹病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行定量檢測(cè)，含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液各個(gè)稀釋度的濃度分別為2.05×105 copies/μl，2.85×104 copies/μl，2.5×103 copies/μl。由此計(jì)算出含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣

15、顆粒懸浮液的原始濃度為2.45×109copies/μl。 5.將噬菌體樣顆粒懸浮液用TSM稀釋液分別稀釋107、108、109倍，濃度分別為2.45×105 copies/mL、2.45×104 copies/mL、2.45×103 copies/mL。含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒每一個(gè)濃度，RNase處理前后實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法定量檢測(cè)Ct值沒有顯著性差別（P值均>0.05）。表明RNase處理對(duì)含風(fēng)疹病毒部

16、分核酸序列的噬菌體樣顆粒的濃度沒有任何影響，也就表明含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒具有耐核糖核酸酶的特性。 6.將濃度為2.45×104 copies/mL的噬菌體樣顆粒懸浮液，置于4℃ EDTA抗凝正常人血漿中，孵育60天，收集的每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的噬菌體樣顆粒懸浮液，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，對(duì)每一標(biāo)本重復(fù)測(cè)定兩次，取平均值。 7.將濃度為2.45×104 copies/mL的噬菌體樣顆粒懸浮液，置于37℃

17、EDTA抗凝正常人血漿中，孵育30天，收集的七個(gè)時(shí)間點(diǎn)的噬菌體樣顆粒懸浮液，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，對(duì)每一標(biāo)本重復(fù)測(cè)定兩次，取平均值。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 研究結(jié)果取得下列新的結(jié)論： 1.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法快速、敏感、特異。 2.采用MS2噬菌體自我組裝技術(shù)能夠成功構(gòu)建表達(dá)含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒。 3.含風(fēng)疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒耐核糖核酸酶。 4.含風(fēng)疹