含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒的研制及其應用研究.pdf

1、風疹病毒是常見的上呼吸道感染病原體，也是常見的胎兒致畸的主要病原之一。風疹病毒主要侵犯上呼吸道粘膜，引起上呼吸道炎癥。風疹病毒感染最嚴重的問題是孕婦感染可導致對嬰兒的先天性損害，尤其前3個月感染風疹病毒，可通過胎盤感染胎兒，導致孕婦流產(chǎn)、死胎，或新生兒一系列的器官畸形等先天性風疹綜合癥。 目前，風疹病毒實驗室診斷越來越多地采用核酸擴增方法來檢測臨床標本中的風疹病毒RNA。但是，目前使用的以RT-PCR為主的RNA病毒核酸擴增檢測

2、試劑盒中，一般采用風疹病毒顆粒、裸露RNA或病毒RNA逆轉錄的cDNA作為陽性質控品或標準品。病毒顆粒和裸露RNA具有潛在的生物傳染性，不穩(wěn)定，易被RNase降解；cDNA不在病毒顆粒內(nèi)，無法模擬臨床標本中病毒核酸的提取及RNA逆轉錄過程，所以，風疹病毒顆粒、裸露RNA或病毒RNA逆轉錄的cDNA作為標準品或質控品，準確性都不理想。因而，人們普遍關心的是病毒核酸檢測試劑盒中使用的陽性參考品和質控品是否具有傳染性以及能否起到陽性全程監(jiān)控的

3、作用。提出假設：利用MS2噬菌體衣殼蛋白自我組裝的特性，采用原核表達技術將風疹病毒E1部分保守序列包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內(nèi)構成噬菌體樣顆粒，組裝成內(nèi)含風疹病毒El部分保守序列耐RNase的噬菌體樣顆粒，并將其作為陽性標準品應用于風疹病毒RNA TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法中，并對其進行評價。 實驗目的： 1.建立風疹病毒RNA TaqmMan實時熒光定量RT-PCR方法。 2.利用MS2噬菌體衣殼

4、蛋白自我組裝的特性，采用原核表達技術將風疹病毒E1部分保守序列包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內(nèi)構成噬菌體樣顆粒，組裝成內(nèi)含風疹病毒E1部分保守序列耐RNase的噬菌體樣顆粒。 3.將構建的風疹病毒RNA噬菌體樣顆粒作為陽性標準品，應用于所建立的風疹病毒RNA TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法中，并對其進行評價。 實驗第一部分： 建立風疹病毒RNA TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法，將風疹病毒RNA逆轉

5、錄cDNA作為RV實時熒光定量RT-PCR陽性標準品，定量檢測已確診的風疹患者咽拭子標本中風疹病毒RNA，評價其敏感度與特異度。 實驗第二部分： 利用MS2噬菌體衣殼蛋白自我組裝的特性，采用原核表達技術將風疹病毒E1部分保守序列包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內(nèi)構成噬菌體樣顆粒。即將大腸桿菌MS2噬菌體衣殼蛋白的編碼基因序列構建到原核表達載體pET30a（+）獲一重組表達載體，然后將風疹病毒E1的部分高度保守RNA序列構建到該

6、重組表達載體上，經(jīng)誘導后表達獲內(nèi)含風疹病毒E1部分保守序列的噬菌體樣顆粒，然后對內(nèi)含風疹病毒E1部分保守序列的噬菌體樣顆粒進行定量分析，并驗證其耐核糖核酸酶（RNase）特性，以及分析其在4℃和37℃血漿中的穩(wěn)定性，并與風疹病毒病毒株在37℃血漿中的穩(wěn)定性進行比較。 實驗第三部分： 將實驗第二部分構建的內(nèi)含風疹病毒E1部分保守序列的噬菌體樣顆粒作為陽性標準品應用于實驗第一部分所建立的風疹病毒RNA TaqMan實時熒光定

7、量RT-PCR方法中，并定量檢測已確診的風疹患者鼻咽拭子標本中風疹病毒RNA，評價其敏感度與特異度。通過對其檢測靈敏度、重復性、敏感度與特異度等指標的測定，并與實驗第一部分中RNA逆轉錄cDNA作為陽性標準品時的相應指標進行比較，來分析實驗第二部分構建的內(nèi)含風疹病毒E1部分保守序列的噬菌體樣顆粒作為陽性標準品的優(yōu)勢所在。 實驗方法： 1.建立風疹病毒RNA TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法，將風疹病毒RNA逆轉錄

8、的cDNA，作為RV實時熒光定量RT-PCR陽性標準品，定量檢測已確診的風疹患者鼻咽拭子標本中風疹病毒RNA，評價其敏感度與特異度。 2.利用MS2噬菌體衣殼蛋白自我組裝的特性，采用原核表達技術將風疹病毒E1部分保守序列包裝到MS2噬菌體衣殼蛋白內(nèi)構成噬菌體樣顆粒，采用基因工程方法構建含部分RV E1、MS2衣殼蛋白及裝配蛋白編碼基因重組表達載體，經(jīng)IPTG誘導表達獲得含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒。 3.行RT-

9、PCR及PCR對噬菌體樣顆粒包繞的內(nèi)容物風疹病毒RNA進行驗證。 4.采用風疹病毒實時熒光定量RT-PCR方法對含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒進行定量分析。 5.將噬菌體樣顆粒懸浮液用TSM稀釋液分別稀釋107、108、109倍，對含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒每一個濃度實施RNase處理，采用實時熒光定量RT-PCR方法定量檢測RNase處理前后的含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒，通過比較RNase處理

10、前后的Ct值有沒有顯著性差別，來驗證含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒耐核糖核酸酶（RNase）特性。 6.將噬菌體樣顆粒懸浮液，置于4℃和37℃EDTA抗凝正常人血漿中，分別孵育60天和30天，來驗證含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒在4℃及37℃血漿中的穩(wěn)定性；將含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液與RV病毒株，分別置于37℃EDTA抗凝正常人血漿中，孵育30天，采用實時熒光定量RT-PCR方法定量測定收集的幾個時

11、間點的噬菌體樣顆粒懸浮液與RV病毒株濃度，來比較噬菌體樣顆粒與RV病毒株在37℃血漿中的穩(wěn)定性。 7.將含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒作為RV實時熒光定量RT-PCR陽性標準品，測定其檢測靈敏度及方法的重復性，并定量檢測已確診的風疹患者鼻咽拭子標本中風疹病毒RNA，確定其敏感度與特異度。 8.將含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒作為實時熒光定量RT-PCR陽性標準品時PCR擴增效率、方法的檢測靈敏度、重復性、方法

12、的敏感度與特異度，與風疹病毒逆轉錄cDNA作為實時熒光定量RT-PCR陽性標準品時的PCR擴增效率、方法的檢測靈敏度、重復性、方法的敏感度與特異度進行比較。 實驗結果： 1.成功建立了風疹病毒RNA TaqMan實時熒光定量RT-PCR方法，采用風疹病毒逆轉錄cDNA作為陽性標準品，PCR擴增效率為1.89，方法的檢測靈敏度為1.0×103copies/ml，方法的重復性結果為：對六個稀釋度陽性標準品重復六次Ct值變異系

13、數(shù)范圍為3.29％～4.36％。以細胞培養(yǎng)法作為金標準，方法的特異度和敏感度分別為88.9％，81.3％。 2.通過部分風疹病毒E1保守序列測序驗證，成功構建與表達含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒。 3.將含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液進行104，105，106，107倍稀釋，然后以各個稀釋度為模板，分別行RT-PCR及PCR。RT-PCR擴增結果為陽性，PCR擴增結果為陰性，表明噬菌體樣顆粒包繞的內(nèi)容物

14、為風疹病毒RNA，不是DNA，也不是DNA污染。 4.將含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液進行104，105，106倍稀釋，然后分別以各個稀釋度為模板，采用風疹病毒實時熒光定量RT-PCR方法進行定量檢測，含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒懸浮液各個稀釋度的濃度分別為2.05×105 copies/μl，2.85×104 copies/μl，2.5×103 copies/μl。由此計算出含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣

15、顆粒懸浮液的原始濃度為2.45×109copies/μl。 5.將噬菌體樣顆粒懸浮液用TSM稀釋液分別稀釋107、108、109倍，濃度分別為2.45×105 copies/mL、2.45×104 copies/mL、2.45×103 copies/mL。含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒每一個濃度，RNase處理前后實時熒光定量RT-PCR方法定量檢測Ct值沒有顯著性差別（P值均>0.05）。表明RNase處理對含風疹病毒部

16、分核酸序列的噬菌體樣顆粒的濃度沒有任何影響，也就表明含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒具有耐核糖核酸酶的特性。 6.將濃度為2.45×104 copies/mL的噬菌體樣顆粒懸浮液，置于4℃ EDTA抗凝正常人血漿中，孵育60天，收集的每一個時間點的噬菌體樣顆粒懸浮液，采用實時熒光定量RT-PCR方法，對每一標本重復測定兩次，取平均值。 7.將濃度為2.45×104 copies/mL的噬菌體樣顆粒懸浮液，置于37℃

17、EDTA抗凝正常人血漿中，孵育30天，收集的七個時間點的噬菌體樣顆粒懸浮液，采用實時熒光定量RT-PCR方法，對每一標本重復測定兩次，取平均值。 實驗結論： 研究結果取得下列新的結論： 1.實時熒光定量RT-PCR方法快速、敏感、特異。 2.采用MS2噬菌體自我組裝技術能夠成功構建表達含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒。 3.含風疹病毒部分核酸序列的噬菌體樣顆粒耐核糖核酸酶。 4.含風疹