多年生黑麥草人工誘發(fā)變異的多態(tài)性分析與鑒定.pdf

1、多年生黑麥草(LoliumperenneL.)屬于禾本科(Gramineae)早熟禾亞科(Pooideae)早熟禾族(Poeae)，是一種重要的冷季型草坪草和牧草草種。但其存在著葉片質(zhì)地不夠細(xì)膩、在北方地區(qū)越冬能力差以及抗旱耐鹽堿能力差等缺點(diǎn)，這大大地限制了它的應(yīng)用范圍。為了發(fā)掘新的種質(zhì)資源，以對(duì)現(xiàn)有多年生黑麥草品種進(jìn)行改良，本文建立了高效的組織培養(yǎng)再生體系，在此基礎(chǔ)上研究了其體細(xì)胞無(wú)性系變異的多態(tài)性，同時(shí)探討了多年生黑麥草的輻射誘變效

2、應(yīng)，并對(duì)輻射誘發(fā)葉片條狀失綠變異株進(jìn)行了分析與鑒定。主要研究結(jié)果如下： 1、建立了高效的多年生黑麥草組織培養(yǎng)再生體系： 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為N6+2，4-D10.0mg·L-1(單位下同)+6-BA0.5+NAA0.5+CH(水解酪蛋白)500；繼代培養(yǎng)基為N6+2，4-D5.0+NAA0.5+6-BA0.5+CH300；分化培養(yǎng)基為N6+6-BA1.0+KT0.5；壯苗培養(yǎng)基為N6；生根培養(yǎng)基為1/2N6+NAA0.2

3、；以上培養(yǎng)基中除生根培養(yǎng)基蔗糖含量為3％以外，其余均為5％，瓊脂含量為6.5％，pH5.8。本體系的愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)85％，分化率可達(dá)77.73％，成苗率達(dá)100％，可為多年生黑麥草的生物技術(shù)育種提供技術(shù)平臺(tái)。 2、研究了體細(xì)胞無(wú)性系變異的多態(tài)性 (1)觀測(cè)表明，再生植株群體在葉形、葉色及開(kāi)花類(lèi)型等方面都表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，出現(xiàn)了淺綠、嫩綠、綠、深綠、墨綠等具不同葉色的植株，并有不需春化就能開(kāi)花的特殊生理類(lèi)型。 (

4、2)核型分析表明，其核型公式為2n=2x=14=2sm+12m(2SAT)。再生植株及實(shí)生苗的倍性水平分析結(jié)果表明，二者所有植株的二倍體細(xì)胞均占60.6％以上，為二倍體類(lèi)型植株。但實(shí)生苗根尖細(xì)胞染色體數(shù)目變異率為12％，變異類(lèi)型有亞單倍體、單倍體、超二倍體。而組織培養(yǎng)再生苗根尖細(xì)胞染色體數(shù)目變異率為40％，變異類(lèi)型除了有亞單倍體、單倍體和超二倍體之外，還有亞二倍體，并出現(xiàn)了四倍體及超四倍體類(lèi)型。再生植株不僅染色體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了染色體斷片、染

5、色體凝聚、染色體倒位等多種類(lèi)型的變異；而且細(xì)胞有絲分裂異常，如染色體橋、染色體不均等、落后染色體等現(xiàn)象也很豐富。豐富的染色體數(shù)目變異、結(jié)構(gòu)變異與細(xì)胞有絲分裂異常證明再生植株具有非整倍化和多整倍化的趨勢(shì)。 (3)利用RAPD技術(shù)檢測(cè)了再生植株的多態(tài)性。篩選出11個(gè)隨機(jī)引物對(duì)多年生黑麥草進(jìn)行擴(kuò)增，其中4個(gè)引物檢測(cè)到了再生植株的多態(tài)性，其多態(tài)率在5.8％至15.4％之間。這說(shuō)明多年生黑麥草再生植株DNA水平上不僅存在廣泛的體細(xì)胞無(wú)性系

6、變異，而且再生植株間變異位點(diǎn)也存在差異，因此證明再生植株群體具有從中選擇不同新種質(zhì)的潛力。 多年生黑麥草廣泛存在的體細(xì)胞無(wú)性系變異，包括形態(tài)變異，染色體變異，DNA水平的變異等，充分說(shuō)明體細(xì)胞無(wú)性系變異是進(jìn)行多年生黑麥草新種質(zhì)選擇的豐富變異源泉之一。這為利用組織培養(yǎng)方法進(jìn)行多年生黑麥草的種質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種培育提供了理論依據(jù)。當(dāng)然，體細(xì)胞無(wú)性系變異無(wú)疑降低了無(wú)性系的遺傳穩(wěn)定性，因此在利用組織培養(yǎng)技術(shù)為平臺(tái)進(jìn)行植物基因工程等研究時(shí)

7、，一定要盡量避免體細(xì)胞無(wú)性系變異的發(fā)生。 3、研究了輻射誘變效應(yīng)，并對(duì)變異株進(jìn)行了分析與鑒定 (1)從輻射對(duì)種子發(fā)芽率、幼苗根長(zhǎng)、幼苗苗長(zhǎng)的影響來(lái)看，50Gy的60Co-γ輻射劑量有一定的促進(jìn)作用，100Gy的輻射劑量對(duì)種子發(fā)芽、幼苗早期的根系和苗生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，250Gy以上的輻射劑量與低劑量間對(duì)種子發(fā)芽率、幼苗根長(zhǎng)及苗長(zhǎng)的影響差異極顯著，而根據(jù)線性回歸方程得出多年生黑麥草的半致死劑量為342Gy，因此對(duì)多年生

8、黑麥草的干種子進(jìn)行60Co-γ輻射的適宜劑量在250～350Gy。 (2)γ射線輻射后，可觀測(cè)到的形態(tài)變異主要有植株矮化和葉色變異，其中值得注意的是葉片條狀失綠變異，包括黃綠型與綠白型兩類(lèi)型。變異株的葉綠素a和葉綠素b含量下降17.7％至48.6％，但是黃綠型變異株葉綠素a與葉綠素b的比值分別上升17.5％和22.5％，說(shuō)明其葉綠素a與葉綠素b下降的速度不同步，葉綠素b下降的幅度較大。以上結(jié)果說(shuō)明，雖然變異株都屬于葉綠素缺乏型突

9、變，但黃綠型屬于低葉綠素含量突變體。黃綠型的凈光合速率分別下降73.7％和29.34％，而綠白型的凈光合速率沒(méi)有表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，說(shuō)明兩類(lèi)型變異株的光合能力不同，同時(shí)說(shuō)明葉綠素下降并未影響綠白型變異株系的光合能力。兩類(lèi)型變異株過(guò)氧化物酶同工酶譜帶均發(fā)生帶缺失或新特異條帶出現(xiàn)的現(xiàn)象，這可能是基因突變或是基因差異表達(dá)的結(jié)果。AFLP標(biāo)記沒(méi)有檢測(cè)到變異的位點(diǎn)，可能與AFLP標(biāo)記的局限性和多年生黑麥草基因組的龐大有關(guān)，或是突變并非發(fā)生在核DNA