新型重組α-型干擾素的克隆、表達(dá)及活性的研究.pdf

1、 本研究課題利用生物工程技術(shù)合成了新型重組α型IFN-α(122Arg)，并對(duì)其生物活性進(jìn)行了檢測(cè)。 新型重組α型IFN基因的克?。焊鶕?jù)全長(zhǎng)DNA序列，設(shè)計(jì)大致相等的8個(gè)片段，正、反向鏈各4個(gè)。其中F1-F4為正向鏈；R1-R4為反向鏈，與設(shè)計(jì)序列相應(yīng)片段互補(bǔ)。利用美國(guó)ABI公司生產(chǎn)的自動(dòng)DNA合成儀進(jìn)行合成。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pUC18進(jìn)行雙酶切后構(gòu)建克隆載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，提取質(zhì)粒，測(cè)定插入的DNA序列表

2、明，與設(shè)計(jì)目標(biāo)一致。 新型重組α型IFN基因在大腸桿菌中的表達(dá)：構(gòu)建表達(dá)載體質(zhì)粒，將含全合成的人新型重組α干擾素基因片段的pUC18重組質(zhì)粒用EcoRI和BamHI雙酶切，與pBV220連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，42℃熱誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。結(jié)果顯示，表達(dá)蛋白主要以包涵體的形式存在。通過(guò)超聲破菌，抽提復(fù)性后以SephacrylS-200HR分離獲得目標(biāo)蛋白。 新型重組α型IFN的生物活性檢測(cè)：為研究其抗乙型肝炎病毒的作用，本試驗(yàn)在

3、轉(zhuǎn)染有乙型肝炎病毒基因的人肝癌細(xì)胞系2.2.15細(xì)胞中，研究了其對(duì)2.2.15細(xì)胞的毒性、HBsAg和HBeAg的分泌以及細(xì)胞培養(yǎng)液中HBV-DNA水平的影響。陽(yáng)性對(duì)照藥為美國(guó)安進(jìn)公司生產(chǎn)的干復(fù)津。 結(jié)果表明：新型重組α型IFN的半數(shù)中毒濃度(TC50)＞10μg/ml。最大無(wú)毒濃度(＞10μg/ml)與2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)8天，對(duì)HBeAg和HBsAg的分泌具有一定的抑制作用。以斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)表明對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液的HBV-DNA水平