牦牛重組干擾素表達及其生物學活性研究.pdf

1、干擾素-α(interferon-α)和干擾素-β(interferon-β)屬于I型干擾素，分別由活化的白細胞和成纖維細胞產生，具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)活性；干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)為Ⅱ型干擾素，主要由活化的T淋巴細胞和NK(細胞產生，絲裂原以及抗原特異性刺激T淋巴細胞克隆也可產生，它具有廣泛抗病毒、抗細胞內寄生菌及胞內寄生蟲、抗腫瘤和免疫調節(jié)作用，在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。由于Ⅰ型、Ⅱ型干擾素

2、在疾病的診斷、治療、預防和疫苗免疫效果檢測等方面均具有重要作用，因此它是現(xiàn)代分子生物學、免疫學和臨床醫(yī)學研究的熱點之一。 本研究通過RT-PCR技術克隆了牦牛干擾素-γ基因，并構建了原核表達質粒pET-30a-yakIFN-Y，用IPTG誘導表達并對其晟佳誘導表達條件進行探索。結果表明：克隆的yakIFN-Y基因序列與GenBank上登錄的牛IFN-γ基因序列的同源性為99％；表達的最佳條件為：在LB培養(yǎng)基中28℃誘導5h，誘導

3、劑濃度為0.5mol/L。然后用鎳柱對可溶性表達產物進行親和層析純化，包涵體經(jīng)DOC洗滌、SKL變性溶解、透析復性進行純化；可溶性表達產物純化后用SDS-PAGE、Western-blot分析證實得到了高純度的重組yakIFN-γ。 在對牦牛干擾素-Ⅰ(yakIFN-a-A/Ⅱ和yakIFN-β)基因進行改造后，選用近年來發(fā)展最快和最具潛能的真核表達系統(tǒng)一畢赤酵母對這三個基因進行表達。首先分別構建了這三個Ⅰ型干擾素基因的重組表達

4、載體pPIC9K-yakIFN-I(pPIC9K-yakIFN-α-A、pPIC9K-yakIFN-α-Ⅱ和pPIC9K-yakIFN-βB)用salⅠ內切酶線性化，電轉化畢赤酵母菌種GS115，使重組表達載體與宿主酵母染色體發(fā)生同源整合，并用G418抗性梯度篩選法，獲得多拷貝重組菌株。對重組菌株利用甲醇進行誘導分泌表達，用SDS-PAGE分析表達情況，發(fā)現(xiàn)重組菌株分泌表達在72h時達高峰，分泌量可達180mg幾左右。 對純化的

5、yakIFN-Y和yakIFN-Ⅰ(yakIFN-α-A、yakIFN-α-Ⅱ和yakIFN-β)重組蛋白的生物學活性研究表明：重組牦牛IFN有誘導刺激淋巴細胞增殖能力，其中yaklFN-Y誘導刺激能力比yakIFN-I強；用yakIFN-Y和yakIFN-Ⅰ抗PRV生物活性研究發(fā)現(xiàn)。yakIFN-Ⅰ的抗病毒活性比yaklFN-Y強，同時yakIFN-α-A和yakIFN-β聯(lián)合使用比單獨使用抗PRV病毒活性強2倍，yakIFN-Y和y