丹頂鶴α干擾素的克隆、表達及抗病毒活性分析.pdf

1、學校代碼：10225學號：S15517學位論文丹頂鶴僅干擾素的克隆、表達及抗病毒活性分析指導教師姓名：申請學位級別：論文提交日期：授予學位單位：邢明偉碩士田荔東北林業(yè)大學2015年4月東北林業(yè)大學學科專業(yè)：論文答辯日期：授予學位日期：答辯委員會主席：馬建章論文評閱人：東多器櫛素大學日C、月月66學年年里55生加如摘要摘要0【干擾素(InterferonOc，IFN—oc)是機體白細胞產生的一種細胞因子，具有抗病毒繁殖、抗腫瘤生長和免疫調

2、節(jié)等多種生物學功能，是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分。近些年來，動物干擾素的研究主要集中于經濟動物，并取得了一定進展，目前已有商品化的雞、犬、豬重組干擾素產品在市場上應用。迄今為止，國內外尚未有關于丹頂鶴(Grus，aponensis)干擾素方面的相關報道。丹頂鶴是大型涉禽，在濕地環(huán)境中屬于食物鏈的上層，是濕地生物多樣性的關鍵物種，被稱為“濕地之神”。我國是世界上丹頂鶴棲息的主要國家，國家林業(yè)局已經把丹頂鶴作為唯一的國鳥候選鳥上報國務院，是

3、國家一級保護動物。近年來，由于環(huán)境變遷和人為干擾，禽流感、新城疫、馬立克氏疾病時常暴發(fā)，野生丹頂鶴數(shù)量逐年下降，全球現(xiàn)存數(shù)量僅為2600只左右，而東亞的大陸種僅1500只左右。本研究利用簡并引物和基因組步移PCR技術首次克隆出丹頂鶴0【干擾素(crlFNⅡ)基因，該基因全長741bp，編碼246個氨基酸，與哺乳動物IFNcc的同源性小于45％，與禽IFN旺基因的同源性在60一80％之間，其巾與鸚鵡的親緣關系最近，同源性高達807％。根據(jù)

4、表達載體的酶切位點設計crlFNQ成熟肽基因表達引物，目的基因亞克隆到原核表達載體pET32a()r1，在大腸桿菌BL21巾進行表達。經SDSPAGE電泳分析，crlFNQ的融合蛋白主要以包涵體的形式存在，大小約43KDa。該包涵體經純化、透析復性處理后加到雞胚成纖維細胞上，而后進行水泡性臼炎病毒(VSV)攻擊，結果發(fā)現(xiàn)重組crlFNq可以抑制水泡性U炎病毒的復制，生物活性最高時達到187x10sU／rag；被兔抗crlFN僅多克降抗體

5、rfl和后的重組crlFN一0【將不再具備抗病毒功能。間接免疫熒光結果表明，crlFN—O【基因也可在雞胚成纖維細胞的細胞質巾得到表達。此外，我們在克隆crIFN僅的過程中曾設計了2對簡并引物(AIF—TYla和AIFTY2b，POAU和AIF—TY2b)，其應用結果表明，AIFTYla和AIFTY2b在擴增禽IFNc【時更為特異，為克降禽O【干擾素未知序列提供了重要參考。通過木研究，我們首次獲得了crlFN—Gc基因，在大腸桿菌和雞胚