急性肝衰竭大鼠微囊化肝細胞移植后肝組織中Skp2的表達與意義.pdf

1、背景和目的：
　　 急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是各種終末期肝臟疾病特別是病毒性肝炎的主要死亡因為之一,病死率高達80％左右。雖然肝移植術(shù)已明顯改善了ALF的預(yù)后,但是由于健康供肝受來源短缺及價格昂貴等因素制約,難以滿足臨床需要。肝細胞移植(hepatocyte transplantation,HCT)是近年肝衰竭治療的研究熱點,但免疫排斥是其發(fā)展瓶頸,近幾年發(fā)展起來的微囊化肝細胞具有有效的免疫隔

2、離屏障,在細胞移植中的研究正受到越來越多的關(guān)注。另外,殘存肝細胞能否及時有效再生并完全或部分發(fā)揮其功能也是ALF患者能否存活的關(guān)鍵,是多因素、多環(huán)節(jié)的病理生理過程。近期,S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase kinase associatedprotein2,Skp2)在參與細胞周期調(diào)控的分子機制中的一些重要發(fā)現(xiàn)使其成為研究熱點,有可能成為藥物及基因治療ALF的可能靶點之一。本實驗將分離的正常大鼠肝細胞微囊化,移植到ALF大鼠腹腔內(nèi),通過

3、觀察大鼠肝功能和肝組織中Skp2的變化等,探討微囊化肝細胞腹腔移植對ALF大鼠肝再生方面的影響。
　　 方法：
　　 1.微囊化大鼠肝細胞的制備用Seglen改良二步胰酶灌注法對健康大鼠肝臟進行肝細胞分離及純化,所得肝細胞懸液在血細胞計數(shù)板上作細胞計數(shù),用0.4％臺盼藍染色判斷細胞產(chǎn)量及存活率。獲取的肝細胞在含有多種輔助因子的RPMI1640混合培養(yǎng)基中與2.0％海藻酸鈉等材料混勻,在自制裝置下制備微囊化肝細胞并觀察形態(tài)

4、學(xué)特征。
　　 2.將雄性成年SD大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖(D-gaiactosamine,D-GalN)制備ALF模型,對照組注射同等體積的生理鹽水。將ALF模型大鼠在造模后18h隨機分成3組:Ⅰ組為模型組；Ⅱ組為裸肝細胞移植組,腹腔內(nèi)植入游離同種異體肝細胞；Ⅲ組為微囊化肝細胞移植組,腹腔內(nèi)植入微囊化同種異體肝細胞。
　　 3.造模后的24、36、48、72、120、168h分別從各組中隨機取6只大鼠,動態(tài)觀察血清肝

5、功能生化指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、總膽紅素(Totai bilirubin,TBil)的變化,留取肝組織用免疫組織化學(xué)方法(SABC法)檢測Skp2蛋白的表達,每次以已知Skp2陽性肝細胞癌切片作為陽性對照,PBS代替第一抗體作為陰性對照,每張切片隨機選取5-10個高倍鏡視野(×400),計算每1

6、000個肝細胞中Skp2陽性細胞數(shù),為Skp2標(biāo)記指數(shù)(skp2 labeling index,Skp2-LI),即Skp2-LI=Skp2陽性細胞數(shù)/1000×100％。
　　 4.取6只正常大鼠的血清及肝組織檢測以上指標(biāo)作為正常對照。
　　 結(jié)果：
　　 1.每只大鼠分離純化后所得肝細胞經(jīng)0.4％臺盼藍染色判斷細胞產(chǎn)量為(8.45±0.97)×107,存活率為91.85±2.2％。
　　 2.獲取的肝

7、細胞在含有多種輔助因子的RPMI1640培養(yǎng)基中與2.0％海藻酸鈉等材料混勻,在自制裝置下制備微囊化肝細胞,經(jīng)0.4％臺盼藍染色后85％以上肝細胞成活,微囊直徑在400-800μm之間。
　　 3.模型建立后24h,大鼠表現(xiàn)為極度虛弱、活動明顯減少、食欲明顯減退、口腔有出血、精神萎靡、嗜睡、抽搐、昏迷等；血ALT、AST和TBil明顯升高；肝臟病理學(xué)表現(xiàn)為肝細胞壞死廣泛而嚴(yán)重,出現(xiàn)彌漫性的大片壞死,細胞溶解,肝索解離,小葉結(jié)構(gòu)模

8、糊不清,失去正常的肝組織結(jié)構(gòu),肝竇明顯擴張并出血,小葉內(nèi)及匯管區(qū)有淋巴細胞和巨噬細胞為主的炎癥細胞浸潤,殘存肝細胞水腫變性。這表明ALF動物模型成功建立。
　　 4.肝功能衰竭模型建立后ALT、AST、TBil迅速升高(P<0.05),并于48h達高峰。同一時間點兩兩比較發(fā)現(xiàn),Ⅱ、Ⅲ組在48、72、120h均明顯低于Ⅰ組(P<0.05),Ⅲ組在36、48、72h均低于Ⅱ組(P<0.05)。Ⅱ、Ⅲ組峰值較Ⅰ組前移。
　　

9、5.各組肝組織Skp2免疫組化情況:正常大鼠肝組織無或極微量Skp2陽性表達(Skp2-LI與其它組比較P<0.05)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組均有明顯Skp2陽性表達,各組組內(nèi)Skp2-LI均在第48-72h達高峰,以后逐漸下降,至第7天時仍有少量陽性細胞。各組間同一時間點的Skp2-LI有差異,Ⅱ、Ⅲ組在36、48、72、120、168h較Ⅰ組高(P<0.05),Ⅲ組在36、48h的Skp2-LI較Ⅱ組高(P<0.05)。
　　 結(jié)論：

10、
　　 1.腹腔注射D-GaIN1.4/kg一次性造模成功,大鼠狀態(tài)、肝臟組織學(xué)及生化學(xué)改變符合ALF。
　　 2.Seglen改良二步胰酶灌注法對健康大鼠肝臟進行肝細胞分離及純化,所得肝細胞產(chǎn)量及存活率符合HCT的要求。
　　 3.HCT能降低ALF大鼠ALF、AST和TBil水平,可能改善ALF預(yù)后。微囊化同種異體肝細胞移植對ALF大鼠的干預(yù)優(yōu)于裸肝細胞。
　　 4.ALF大鼠肝組織中有Skp2表達,

11、免疫組化顯示主要為肝細胞,以中央靜脈周圍、匯管區(qū)及壞死區(qū)周圍表達最為明顯,在壞死區(qū)中心表達明顯少于周圍區(qū),Skp2表達的部位和量的變化規(guī)律提示其與肝細胞再生有關(guān)。微囊化同種異體肝細胞移植可提高Skp2蛋白的表達,可能是通過參與促進殘存肝細胞的再生和抑制肝細胞凋亡而發(fā)揮治療作用。
　　 5.動態(tài)觀察Skp2的表達,可以較好地判斷ALF肝細胞的再生情況,有利于ALF預(yù)后的判斷,如何適當(dāng)提高Skp2基因的表達為ALF治療提供了新的思路