肝細胞包裹用微囊材料的研制及其治療大鼠肝衰竭模型的實驗研究.pdf

1、急性肝功能衰竭發(fā)病急，病情十分嚴重，保守治療效果不佳。肝細胞移植是治療肝衰竭的行之有效的途徑之一，異體的肝細胞是很好的種子細胞，但是異體肝細胞移植若不使用免疫抑制劑則面臨著受體發(fā)生的急性免疫排斥反應。微囊技術是指由半透膜包被生物活性物質(zhì)的一種結構，該結構可以阻遏免疫細胞以及引起免疫排斥反應的大分子抗體，同時允許氧氣，營養(yǎng)物質(zhì)和一些具有生物活性的小分子物質(zhì)自由通透，因此微囊能為移植物提供有效的免疫保護，使其免受異體排斥反應。 我們

2、利用海藻酸鈉制備海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉(Alginate-Polylysine-Alginate，APA)和海藻酸鋇-聚賴氨酸-海藻酸鈉(Ba-alginate-Polylysine-Alginate，BPA)微囊，并對兩種微囊的物理性能、生物相容性、微囊化細胞的功能發(fā)揮進行研究，然后體內(nèi)移植BPA微囊化肝細胞和共包裹睪丸支持細胞與肝細胞治療肝衰竭動物模型，旨在進一步改進微囊制作條件，提高微囊化肝細胞移植的治療效果，為微囊化肝細胞

3、移植的深入研究和向臨床過渡提供理論依據(jù)。 主要研究內(nèi)容包括以下四個部分： 一、微囊的制備及條件的優(yōu)化通過調(diào)整靜電液滴法制備微囊的多種影響因素，優(yōu)化制備條件，根據(jù)不同移植物的要求制備不同粒徑大小的微囊，成功制備大小均勻，囊壁光滑的微囊。用于包被肝細胞，本試驗采用靜電場為6kV/1.5cm，泵速度為15ml/h，針頭內(nèi)徑為0.25mm，海藻酸鈉濃度為2％，多聚賴氨酸濃度為0.05％，作用時間為6min，制備的微囊粒徑為300

4、-400μm。 二、微囊的物理與生物學性能評價1．采用機械震蕩實驗測定不同類型微囊的機械強度和體外模擬體液長期培養(yǎng)測定不同類型微囊的滲透壓強度，結果表明，BPA微囊比APA微囊具有較高的機械強度和長期穩(wěn)定性。 2．采用體內(nèi)移植實驗測定微囊在肌肉內(nèi)的移植強度以及腹腔移植后的生物相容性，結果表明：APA微囊肌肉移植一個月后，可見多數(shù)微囊出現(xiàn)變形，明顯膨脹，纖維化較明顯，而BPA微囊仍然可以保持近似球形，且膨脹率不大，僅有輕度

5、纖維化。微囊腹腔移植后，APA微囊的56天回收率為76.4±8.4％，纖維化包裹的微囊占3.6±1.3％；而BPA微囊的56天回收率為79.4±7.9％，纖維化包裹的微囊占3.5±1.7％。這些結果說明我們制備的BPA微囊比APA微囊的移植強度要好(p<0.005)，生物相容性相似。 3．采用激光掃描共聚焦顯微鏡和FTTC標記的Dextran測得微囊膜的通透性，以了解兩種微囊作為免疫隔離屏障并支持囊內(nèi)細胞生存的基礎。結果表明：兩

6、種微囊膜均具有一定的截割范圍，4kD的小分子物質(zhì)可自由擴散進入微囊內(nèi)；70kDa的中等分子物質(zhì)可部分通過：而150 kDa的大分子物質(zhì)不能通過微囊膜。免疫球蛋白分子量最小的IgG近似于150 kDa，這說明我們制備的微囊膜可以作為免疫隔離屏障并支持囊內(nèi)細胞生存。 三、細胞的原代分離培養(yǎng)鑒定以及微囊化細胞的制備1．采用改良的Seglen兩步門靜脈膠原酶灌注法原代分離大鼠肝細胞，以血細胞計數(shù)板計算肝細胞的產(chǎn)率，并用0.4％的臺盼藍拒

7、染實驗檢測肝細胞的成活率。若肝細胞的成活率在90％以下，則加用Percoll細胞分離液進一步純化。 2．制備微囊化肝細胞，取其培養(yǎng)液與游離肝細胞的培養(yǎng)液，檢測白蛋白含量，結果表明現(xiàn)在體外的培養(yǎng)液中檢測到白蛋白的分泌兩者差異不大，而且培養(yǎng)過程中，2周內(nèi)微囊及囊內(nèi)肝細胞保持完整形態(tài)，幾無破損，光鏡下動態(tài)觀察微囊形態(tài)完整，表面光滑，因此可知BPA微囊不影響肝細胞功能的發(fā)揮。 四、微囊化肝細胞移植治療肝衰動物模型由于肝衰會導致肝

8、細胞的大面積死亡，而肝細胞壞死時，肝細胞內(nèi)的各種酶釋放到血液中，導致酶指標增高。因此我們將制備的微囊化肝細胞或者共包裹的肝細胞和睪丸支持細胞移植入肝衰大鼠模型的腹腔，于移植后的1d、3d、7d、2w、3w、4w、5w、6w眼眥靜脈取血，測血液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，白蛋白(ALB)的值，結果表明：共包裹組的數(shù)值明顯高于單獨包裹肝細胞的組，而微囊化肝細胞組又高于游離的肝細胞組，證明睪丸支持細胞的免疫豁免