腎上腺皮質(zhì)增生與腺瘤差異表達(dá)基因的篩選和研究.pdf

1、背景與目的： 原醛癥是繼發(fā)性高血壓的常見原因之一，最近應(yīng)用血漿醛固酮濃度與腎素的比例作為在高血壓病人群中檢出原醛癥的篩查試驗(yàn)中表明，在亞洲高血壓病人群中原醛癥的發(fā)病率至少為5％-13％；同樣的方法發(fā)現(xiàn)在歐洲高血壓病人群中原醛癥的發(fā)病率可到5％-25％。腎上腺皮質(zhì)增生和腺瘤是原醛癥最常見的兩種亞型。腎上腺皮質(zhì)腺瘤患者手術(shù)能治愈，而皮質(zhì)增生需要以藥物治療為主結(jié)合手術(shù)且復(fù)發(fā)率較高。因此，鑒別腎上腺皮質(zhì)增生和腺瘤對(duì)于臨床工作有重要的意義

2、。但是這兩種病變的臨床表現(xiàn)都是高血壓、高醛固酮血癥，低血鉀，當(dāng)前我們只能靠一些實(shí)驗(yàn)室的生化指標(biāo)、影像學(xué)及術(shù)后標(biāo)本的病理結(jié)果對(duì)兩種疾病進(jìn)行鑒別。我們發(fā)現(xiàn)在病理上兩種病變存在很大差異，因此可以認(rèn)為兩種病變的發(fā)生必然和不同基因的表達(dá)相關(guān)聯(lián)。隨著基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法的飛速發(fā)展，特別是人類基因組計(jì)劃的全面完成，利用基因芯片技術(shù)尋找差異表達(dá)基因已經(jīng)成為分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。該技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、及結(jié)果可靠、可重復(fù)性良好等特點(diǎn)，因此利用基因芯片技

3、術(shù)能迅速有效的分離、克隆腎上腺皮質(zhì)增生和腺瘤組織之間的差異表達(dá)基因，這些基因?qū)τ诹私饧膊“l(fā)生、發(fā)展分子生物學(xué)機(jī)制以及兩種疾病在臨床中診斷、鑒別診斷、治療等方面都有十分重要的意義，特別是在藥物及手術(shù)治療都不能有效控制腎上腺皮質(zhì)增生病變的問題上開辟新的治療途徑，從而能有效的較少該病變的復(fù)發(fā)。 方法： 首先制備包含22k個(gè)基因的寡核苷酸基因芯片，分別提取腎上腺皮質(zhì)增生和腺瘤及正常腎上腺組織的總RNA，然后將總RNA采用直接熒光

4、標(biāo)記法逆轉(zhuǎn)錄成Cy5或Cy3標(biāo)記的eDNA，腎上腺皮質(zhì)增生和腺瘤及正常腎上腺組織的cDNA分別與基因芯片雜交，雜交后的芯片經(jīng)過處理后ScanArray Express雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描，得到雜交圖像，采用GenePix Pro 4.0圖像分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，得出雜交信號(hào)數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行歸一化，最后以Radio≥2或≤0.5的標(biāo)準(zhǔn)來確定差異表達(dá)基因。本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)中是應(yīng)用同一正常腎上

5、腺組織與兩種病變分別比較，因此可以認(rèn)為兩種病變之間仍有可比性，能應(yīng)用相同的方法篩選出腎上腺皮質(zhì)增生和腺瘤之間的差異表達(dá)基因。 結(jié)果： 在本實(shí)驗(yàn)中，腎上腺皮質(zhì)腺瘤與正常腎上腺相比較共篩選出個(gè)333個(gè)差異表達(dá)基因，其中118個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，215個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；腎上腺皮質(zhì)增生病變與正常腎上腺比較中共篩選出133個(gè)差異表達(dá)基因，其中49個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，84個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。通過計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析及文獻(xiàn)檢索，我們篩查出來部分腎上腺皮質(zhì)

6、增生和腺瘤之間的差異表達(dá)基因，這些基因按照功能分類包括了抑癌基因、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、受體等多種類型，這些基因在兩種病變的發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 結(jié)論： 1．原發(fā)性醛固酮增多癥中腎上腺皮質(zhì)增生和腺瘤相比存在較大的差異，通過以上方法能有效地篩選出原發(fā)性醛固酮增多癥中腎上腺皮質(zhì)增生和腺瘤的差異表達(dá)基因。 2．對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析及文獻(xiàn)檢索，確定其身份及功能，例如：(1)STAR、C

7、YP11B、MCR2等基因在調(diào)節(jié)醛固酮的生成和分泌中發(fā)揮重要的作用；(2)KDR基因的表達(dá)與腫瘤內(nèi)部血管的生長(zhǎng)密切相關(guān)，而且通過免疫組化等方法對(duì)KDR基因的研究可能有助于在組織學(xué)上進(jìn)一步區(qū)別腎上腺皮質(zhì)增生和腺瘤。這些基因在原發(fā)性醛固酮增多癥中腎上腺皮質(zhì)增生和腺瘤兩種亞型的發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制及進(jìn)一步在疾病的診斷、鑒別診斷、治療及預(yù)后分析的應(yīng)用上都有重要的意義。 3．本研究所發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因片段為國(guó)內(nèi)首次構(gòu)建原發(fā)性醛固酮增多癥基