人牙齦成纖維細(xì)胞構(gòu)建組織工程化血管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人牙齦成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究
　　目的：
　　體外分離培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fibroblasts，HGFs）誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）。探討人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）在體外分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）的潛能。
　　方法：
　　1牙齦組織的獲取和分離
　　正常人牙齦組織取自河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口

2、腔頜面外科，患者下頜阻生齒拔除術(shù)。牙齦組織手術(shù)切取后帶回實(shí)驗(yàn)室，在無(wú)菌條件下分離牙齦上皮及結(jié)締組織，留取牙齦結(jié)締組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
　　2人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）的培養(yǎng)
　　培養(yǎng)液選用含15％胎牛血清的L-DMEM。牙齦結(jié)締組織剪成1 mm×1 mm的組織塊，進(jìn)行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80%融合后，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。
　　3人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）的鑒定
　　3.1流式細(xì)胞儀檢測(cè)人牙齦成纖維細(xì)胞（ HG

3、Fs），選擇波形蛋白（vimentin）抗體和CD31抗體鑒定成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　3.2人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）的RT-PCR鑒定
　　TRIzol法提取成纖維細(xì)胞的總RNA；
　　以分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞總 RNA的純度及濃度；
　　應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit合成第一鏈cDNA；
　　以適量反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模版，在

4、TaqDNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
　　將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，然后置于凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，以GAPDH作為內(nèi)參照校正，用目的基因的吸光度與GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。
　　3.3人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）免疫細(xì)胞化學(xué)染色
　　采用鼠抗人vimentin單克隆抗體、鼠抗人III型膠原單克隆抗體，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)vimentin蛋白和III型膠原蛋白在人

5、牙齦成纖維細(xì)胞中的表達(dá)與分布。
　　3.4人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）免疫熒光染色
　　采用兔抗人S-100A4抗體和鼠抗人肌動(dòng)蛋白α（α-SMA）抗體，通過(guò)免疫熒光染色法檢測(cè) S-100A4蛋白和α-SMA蛋白在人牙齦成纖維細(xì)胞HGFs中的表達(dá)與分布。
　　4生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
　　采用MTT法測(cè)定第1~6代人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）1~7天的OD490 nm處的吸光值。
　　5內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物在分化中的

6、人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）中的表達(dá)
　　采用vimentin，血管生成素受體2（tie2）抗體和血管生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）抗體，通過(guò)Western blot半定量vimentin蛋白，tie2蛋白和VEGFR2蛋白在不同VEGF165濃度組和不同誘導(dǎo)周期組中的表達(dá)量。
　　Real-time PCR相對(duì)定量法檢測(cè)不同VEGF165濃度組和不同誘導(dǎo)周期組中vimentin基因，tie2基因，血管生成素2（Ang2）基

7、因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。
　　6誘導(dǎo)過(guò)程中的形態(tài)學(xué)觀察
　　倒置顯微鏡觀察8 ng/ml VEGF165誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）0，7，14，21，28，35，42和50天時(shí)的形態(tài)學(xué)變化。
　　7誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的鑒定
　　7.1免疫細(xì)胞化學(xué)染色
　　8ng/ml VEGF165誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞35天后，采用鼠抗人 CD34單克隆抗體、鼠抗人 CD31單克隆抗體，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)C

8、D34蛋白和CD31蛋白在誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的表達(dá)與分布。
　　7.2免疫熒光染色
　　8ng/ml VEGF165誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞35天后，采用血管性假血友病因子（vWF）抗體和上皮鈣粘附分子（E-cadherin）抗體，通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)vWF蛋白和E-cadherin蛋白在誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的表達(dá)與分布。
　　7.3 RT-PCR鑒定誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮樣細(xì)胞中tie2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。
　　7

9、.4經(jīng)8 ng/ml VEGF誘導(dǎo)35天后，通過(guò)透射電鏡觀察誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮樣細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　8流式細(xì)胞儀測(cè)定誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率
　　采用CD34抗體和CD31抗體，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞中CD34和CD31的陽(yáng)性表達(dá)率，以評(píng)估人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）的轉(zhuǎn)化率。
　　9成管能力測(cè)試檢測(cè)誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能
　　將誘導(dǎo)前后細(xì)胞接種于24孔板的Matrigel基質(zhì)膠中

10、，Olympus IX71倒置顯微鏡下觀察管狀排列結(jié)構(gòu)和完整度并計(jì)數(shù)管狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量，對(duì)誘導(dǎo)后血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）的功能進(jìn)行評(píng)估。
　　結(jié)果：
　　1人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）的基本生長(zhǎng)情況
　　細(xì)胞多數(shù)呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核較大，呈圓形或橢圓形。原代培養(yǎng)以組織塊為中心向周圍輻射生長(zhǎng)，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好，3~4天即可生長(zhǎng)達(dá)90%~100%。
　　2人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）的鑒定結(jié)果
　　2.1流式細(xì)胞

11、儀檢測(cè)人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）表面抗原vimentin和CD31表達(dá)結(jié)果
　　培養(yǎng)的成纖維樣細(xì)胞表面抗原 vimentin表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為（97.13±0.62）%；而表面抗原 CD31表達(dá)率僅為（8.64±1.55）%。兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　2.2細(xì)胞RT-PCR鑒定結(jié)果
　　細(xì)胞 RT-PCR結(jié)果顯示人牙齦成纖維細(xì)胞（ HGFs）特異性表達(dá)vimentin，S-100A4和α-SMA。然

12、而，tie2在細(xì)胞中不表達(dá)。
　　2.3細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果
　　鼠抗人vimentin單克隆抗體和鼠抗人III型膠原單克隆抗體染色結(jié)果顯示細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)。
　　2.4細(xì)胞的免疫熒光染色鑒定結(jié)果
　　兔抗人S-100A4多克隆抗體和鼠抗人α-SMA單克隆抗體熒光染色結(jié)果顯示細(xì)胞分別呈綠色熒光和紅色熒光表達(dá)。
　　3人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果
　　結(jié)果顯示第2代或第3代人牙齦成纖

13、維細(xì)胞（HGFs）的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期比其余代次細(xì)胞增殖水平顯著升高（P<0.05），而第2代或第3代細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞增殖水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　4內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物在分化中的人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）中的表達(dá)
　　Western blot結(jié)果顯示，8 ng/ml VEGF165誘導(dǎo)時(shí)tie2蛋白和VEGFR2的相對(duì)表達(dá)量最高。Real-time PCR結(jié)果顯示，經(jīng)8 ng/ml VEGF165誘導(dǎo)時(shí)tie2基

14、因和Ang2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高。Western blot結(jié)果顯示，誘導(dǎo)周期達(dá)到35天時(shí)tie2蛋白和VEGFR2蛋白的相對(duì)表達(dá)含量最高。Real-time PCR結(jié)果顯示，誘導(dǎo)周期達(dá)到35天時(shí)tie2和Ang2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量最高。
　　5 VEGF165對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響
　　人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）經(jīng)8 ng/ml VEGF165誘導(dǎo)7~14天，大部分細(xì)胞仍然呈現(xiàn)叢狀或束狀排列；14~21

15、天時(shí)，細(xì)胞逐漸排列形成多邊形上皮細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)；21~28天時(shí)，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)融合成簇現(xiàn)象，逐漸形成鵝卵石樣或鋪路石樣的生長(zhǎng)排列形式；28~35天時(shí)，絕大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)鋪路石樣的生長(zhǎng)形式以及形成血管腔樣結(jié)構(gòu)。
　　6免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定
　　鼠抗人CD34單克隆抗體和鼠抗人CD31單克隆抗體染色結(jié)果顯示細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)。
　　7 RT-PCR鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞tie2基因的表達(dá)
　　RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組

16、相比，tie2基因在誘導(dǎo)后細(xì)胞中顯著表達(dá)。
　　8免疫熒光染色對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定
　　兔抗人 vWF抗體和兔抗人 E-cadherin抗體熒光染色結(jié)果顯示細(xì)胞分別呈紅色熒光表達(dá)。
　　9誘導(dǎo)后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察
　　透射電鏡觀察顯示，細(xì)胞表面呈現(xiàn)微絨毛結(jié)構(gòu)，細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)溶酶體結(jié)構(gòu)及內(nèi)皮細(xì)胞特有的Weibel-Palad小體（W-P小體）。
　　10流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）向血管內(nèi)皮細(xì)

17、胞（VEC）分化的轉(zhuǎn)分化率
　　誘導(dǎo)后細(xì)胞組CD34和CD31細(xì)胞表型陽(yáng)性率與對(duì)照組相比，差異有顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　11成管能力測(cè)試實(shí)驗(yàn)比較誘導(dǎo)前后細(xì)胞形成小管的能力
　　誘導(dǎo)形成的細(xì)胞組在Matrigel基質(zhì)膠中24小時(shí)呈現(xiàn)管狀樣結(jié)構(gòu)，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組成管數(shù)目顯著增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　第二部分人牙齦成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞的研究
　　目的：

18、r>　　體外分離培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fibroblasts，HGFs）并誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC），證實(shí)人牙齦成纖維細(xì)胞（ HGFs）具有在體外分化為血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的潛能。
　　方法：
　　1人牙齦組織的獲取，分離和細(xì)胞的培養(yǎng)同第一部分。
　　2人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）的鑒定
　　2.1人牙齦成纖維細(xì)

19、胞（HGFs）的RT-PCR鑒定同第一部分。
　　2.2人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）免疫細(xì)胞化學(xué)染色同第一部分。
　　2.3人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）免疫熒光染色同第一部分。
　　3生長(zhǎng)曲線的測(cè)定同第一部分。
　　4平滑肌細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物在誘導(dǎo)分化中的人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）中的表達(dá)
　　采用波形蛋白（ vimentin），肌動(dòng)蛋白α（α-SMA）和肌球蛋白（SM-MHC）抗體，通過(guò)Western bl

20、ot半定量vimentin蛋白，α-SMA蛋白和SM-MHC蛋白在不同PDGF-BB濃度組和不同誘導(dǎo)周期組中的表達(dá)量。
　　Real-time PCR相對(duì)定量法檢測(cè)不同PDGF-BB濃度組和不同誘導(dǎo)周期組中vimentin基因，α-SMA基因，SM-MHC基因，Calponin1（Cnn1）基因和平滑肌22α（SM22α）基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。
　　5誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
　　倒置顯微鏡觀察10 ng/ml

21、PDGF-BB（含2 ng/ml TGF-β1）誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）0，7，14，21，28和35天時(shí)的形態(tài)學(xué)變化。
　　6誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定
　　6.110 ng/ml PDGF-BB（含2 ng/ml TGF-β1）誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）28天后，采用兔抗人α-SMA抗體和鼠抗人SM-MHC抗體，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)α-SMA蛋白和SM-MHC蛋白在誘導(dǎo)后血管平滑肌樣細(xì)胞的表達(dá)與分布。
　

22、　6.2采用Cnn1抗體和SM22α抗體，通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)Cnn1蛋白和SM22α蛋白在誘導(dǎo)后血管平滑肌樣細(xì)胞的表達(dá)與分布。
　　6.3 RT-PCR鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞中α-SMA基因和SM-MHC基因的表達(dá)量。
　　6.4經(jīng)10 ng/ml PDGF-BB（含2 ng/ml TGF-β1）誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）28天后，通過(guò)透射電鏡觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：
　　1人牙齦成纖維細(xì)胞（HGF

23、s）的基本生長(zhǎng)情況:結(jié)果同第一部分。
　　2人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）的鑒定
　　2.1細(xì)胞RT-PCR的鑒定
　　細(xì)胞特異性表達(dá)vimentin基因和S-100A4基因，弱表達(dá)α-SMA基因，不表達(dá)SM-MHC基因。
　　2.2細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定:結(jié)果同第一部分。
　　2.3細(xì)胞的免疫熒光染色鑒定:結(jié)果同第一部分。
　　3人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果:結(jié)果同第一部分。

24、　　4平滑肌細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物在分化中的人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）中的表達(dá)
　　Western blot結(jié)果顯示，誘導(dǎo)濃度達(dá)到10 ng/ml PDGF-BB時(shí)，α-SMA蛋白和SM-MHC蛋白的相對(duì)表達(dá)量最大；誘導(dǎo)周期達(dá)到28天時(shí)，α-SMA蛋白和SM-MHC蛋白的相對(duì)表達(dá)含量最高。
　　Real-time PCR結(jié)果顯示，當(dāng)經(jīng)10 ng/ml PDGF-BB誘導(dǎo)時(shí)α-SMA基因，SM-MHC基因，Cnn1基因和SM22α基

25、因的mRNA相對(duì)表達(dá)量最高；誘導(dǎo)周期達(dá)到28天時(shí)，α-SMA基因，SM-MHC基因，Cnn1基因，SM22α基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量最高。
　　5誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
　　人牙齦成纖維細(xì)胞（ HGFs）經(jīng)10 ng/ml PDGF-BB（含2 ng/ml TGF-β1）誘導(dǎo)0~7天，大部分細(xì)胞仍然呈現(xiàn)叢狀；7~21天時(shí)，部分細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)，細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)一段時(shí)間的減少狀態(tài)，但仍然為叢狀排列；21~28天時(shí)，細(xì)胞伸出偽足

26、并相互連接，在密集與稀疏處相互交錯(cuò)略呈“峰谷”狀，可與成纖維細(xì)胞相鑒別；28~35天，絕大多數(shù)細(xì)胞已呈典型的“峰谷”狀生長(zhǎng)排列方式。
　　6免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定
　　結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后細(xì)胞兔抗人α-SMA抗體呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，鼠抗人SM-MHC抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)。對(duì)照組α-SMA仍呈陽(yáng)性反應(yīng)，SM-MHC單克隆抗體呈陰性反應(yīng)。
　　7免疫熒光染色對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定
　　結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后細(xì)胞SM22α抗體和Cn

27、n1抗體分別經(jīng)Rhodamine和FITC熒光染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，胞漿分別呈紅色熒光和綠色熒光表達(dá)。
　　8細(xì)胞RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞α-SMA和SM-MHC基因的表達(dá)
　　誘導(dǎo)組α-SMA基因mRNA的相對(duì)含量明顯高于未誘導(dǎo)組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；誘導(dǎo)組SM-MHC基因mRNA的相對(duì)含量明顯高于未誘導(dǎo)組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　9誘導(dǎo)后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果
　　透射電鏡觀察可見胞漿中有

28、少量高爾基復(fù)合體，線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，大量粗細(xì)不一的肌絲樣結(jié)構(gòu)或肌絲束以及電子密度較高的密體樣結(jié)構(gòu)等。
　　第三部分兔脫細(xì)胞血管基質(zhì)聯(lián)合類人Ι型膠原合成支架材料的生物學(xué)特性及其細(xì)胞相容性的研究
　　目的：
　　應(yīng)用凍干技術(shù)將類人 I型膠原蛋白（Human-like collagen I，HLC-I）合成高分子材料與兔脫細(xì)胞血管基質(zhì)（acellular vascular matrix，ACVM）支架材料復(fù)合，制備ACVM

29、-0.25%HLC-I血管支架材料，探討其生物學(xué)特性及與細(xì)胞的相容性。
　　方法：
　　1 ACVM基質(zhì)的制備
　　稱量家兔體重，注射麻醉并結(jié)扎預(yù)取動(dòng)脈分支，迅速切取血管，浸入生理鹽水中，沖洗管腔后浸入含有1%苯扎溴銨的PBS復(fù)合液中60分鐘，沖洗后0.1%胰蛋白酶處理6小時(shí)，沖洗后移入1% TritonX-100中72小時(shí)，制備的ACVM基質(zhì)浸入PBS中保存于4?C冰箱。
　　2 ACVM基質(zhì)HE染色，觀察脫細(xì)

30、胞情況。
　　3 ACVM基質(zhì)Masson染色，觀察脫細(xì)胞情況及ACVM基質(zhì)中的膠原成分。
　　4 ACVM與HLC-I的復(fù)合
　　丙烯酸預(yù)處理 ACVM基質(zhì)，紫外燈輻射30分鐘，蒸餾水洗凈數(shù)次后放入真空干燥器中；預(yù)處理 ACVM浸入到碳化二亞胺水溶性中，4oC冰箱中1小時(shí)；將不同濃度 HLC-I（0.10 mg/ml，0.25 mg/ml，0.50 mg/ml，0.75 mg/ml，1.00 mg/ml）復(fù)合于 AC

31、VM基質(zhì)表面12小時(shí)；清洗后ACVM-HLC-I支架減壓干燥，4 oC保存?zhèn)溆谩?br>　　5人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）的培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定，實(shí)驗(yàn)方法同第一部分。
　　6 MTT法測(cè)定 HLC-I與 ACVM的交聯(lián)的最佳濃度
　　在不同濃度 ACVM-HLC-I支架上接種人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs），分別培養(yǎng)1，4，7天時(shí)測(cè)量各孔 OD490 nm的吸光值，以確定 HLC-I與ACVM基質(zhì)交聯(lián)的最佳濃度。
　　7支架的吸

32、水性測(cè)試
　　實(shí)驗(yàn)分為兩組，ACVM-0.25% HLC-I支架組和 ACVM支架組，室溫條件下，分別稱量?jī)山M材料浸入 PBS前后的重量，干燥狀態(tài)下重量標(biāo)記為 W0，浸濕24小時(shí)后重量標(biāo)記為 W1。支架材料的吸水量百分比計(jì)算公式：W1-W0／W0×100%。
　　8支架的力學(xué)性能測(cè)定
　　采用 Zwick/Roell Z020型萬(wàn)能力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)來(lái)檢測(cè)標(biāo)本的拉伸強(qiáng)度，斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率。實(shí)驗(yàn)分為未脫細(xì)胞的兔血管組，單純

33、ACVM支架組和 ACVM-0.25%HLC-I支架組進(jìn)行檢測(cè)，記錄應(yīng)力和應(yīng)變，繪制出應(yīng)力-應(yīng)變曲線。
　　9支架的壓力爆破實(shí)驗(yàn)
　　實(shí)驗(yàn)分為未脫細(xì)胞的兔血管組，單純ACVM支架組和ACVM-0.25%HLC-I支架組。用注滿生理鹽水的壓力槍進(jìn)行壓力爆破實(shí)驗(yàn)。
　　10掃描電鏡觀察支架表面結(jié)構(gòu)
　　A組為未脫細(xì)胞的血管組織；B組為 ACVM支架；C組為ACVM-0.25%HLC-I支架，分別觀察支架的側(cè)面和內(nèi)面。

34、
　　11 CCK-8試劑盒檢測(cè) ACVM-0.25%HLC-I支架的體外細(xì)胞毒性
　　待測(cè)樣品分為 ACVM-0.25%HLC-I支架組和單純 ACVM支架組，鋪于96孔板中，與100μl細(xì)胞懸液培養(yǎng)24，48和72小時(shí)，用 CCK-8試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀測(cè)定各組在450 nm處的吸光度，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞毒性活力（%），即相對(duì)生長(zhǎng)率來(lái)評(píng)價(jià)支架的體外細(xì)胞毒性。
　　結(jié)果：
　　1 ACVM基質(zhì)大體觀察結(jié)果
　

35、　ACVM基質(zhì)呈乳白色，管腔塌陷，管壁變薄，彈性消失并可折疊。
　　2 HE染色觀察ACVM基質(zhì)脫細(xì)胞程度
　　結(jié)果顯示，內(nèi)膜層呈現(xiàn)透明狀，無(wú)藍(lán)染細(xì)胞核及細(xì)胞碎片等殘留物，中膜層已經(jīng)無(wú)平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，未見藍(lán)染細(xì)胞核及細(xì)胞碎片等物質(zhì)，整個(gè)管壁變薄，纖維結(jié)構(gòu)稀疏。
　　3 Masson染色觀察ACVM基質(zhì)膠原成分及脫細(xì)胞程度
　　結(jié)果顯示，ACVM基質(zhì)中血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞和大部分肌纖維等成分脫落，大部分為染

36、成綠色的膠原纖維和少量染成紅色的肌纖維，但纖維結(jié)構(gòu)稀疏。
　　4人牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fibroblasts，HGFs）的培養(yǎng)、傳代及鑒定結(jié)果
　　結(jié)果同第一部分。
　　5 MTT法測(cè)定HLC-I與ACVM支架的最佳復(fù)合濃度
　　細(xì)胞接種于不同濃度HLC-I復(fù)合的ACVM支架后經(jīng)1，4和7天培養(yǎng)后，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.25%HLC-I復(fù)合于ACVM支架上更有利于細(xì)胞的增殖，即為ACV

37、M-0.25%HLC-I支架。
　　6 ACVM-0.25%HLC-I的吸水性測(cè)試結(jié)果
　　結(jié)果顯示，ACVM-0.25%HLC-I支架與ACVM支架相比，吸水能力無(wú)差別，二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　7 ACVM-0.25%HLC-I支架材料的生物力學(xué)測(cè)定結(jié)果
　　ACVM-0.25% HLC-I支架的應(yīng)力和應(yīng)變均大于 ACVM支架，而與未脫細(xì)胞兔血管無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ACVM-0.25% HLC-I支架

38、的抗拉伸能力與未處理的天然兔血管更加接近，而 ACVM支架的抗拉伸能力最差。ACVM-0.25% HLC-I支架的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率均與未處理的天然兔血管相近，而 ACVM支架斷裂強(qiáng)度與未處理的天然兔血管相比有所降低，其斷裂伸長(zhǎng)率卻有所增加。
　　8 ACVM-0.25%HLC-I支架材料的壓力爆破實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　ACVM-0.25% HLC-I支架的爆破壓力大于單純 ACVM基質(zhì)的爆破壓力（P<0.05）；而 ACVM-0

39、.25% HLC-I支架與未經(jīng)脫細(xì)胞處理兔血管的爆破壓力無(wú)差別（P>0.05）。
　　9掃描電鏡觀察ACVM-0.25%HLC-I支架表面結(jié)構(gòu)的超微結(jié)構(gòu)
　　經(jīng)0.25%的HLC-I復(fù)合后，掃描電鏡可見ACVM-0.25% HLC-I支架與ACVM基質(zhì)相比，纖維更加致密，內(nèi)膜層，中膜層和外膜層分界不清，各層均未見細(xì)胞分布。
　　10 ACVM-0.25%HLC-I支架的體外細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果
　　ACVM-0.25

40、% HLC-I支架和 ACVM支架的相對(duì)生長(zhǎng)率（RGR）在24，48和72小時(shí)時(shí)各時(shí)間點(diǎn)均在75%以上，ACVM-0.25%HLC-I支架和 ACVM支架的體外細(xì)胞毒性評(píng)估均合格。隨著時(shí)間的增加（24，48和72小時(shí)），細(xì)胞在兩種支架材料上的增殖情況為逐漸上升的趨勢(shì)。
　　第四部分體外構(gòu)建組織工程化血管及裸鼠體內(nèi)動(dòng)態(tài)強(qiáng)化的研究
　　目的：
　　采用分層方式將人牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fibrobl

41、asts，HGFs）誘導(dǎo)分化形成的血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）和血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cell，VEC）種植于 ACVM-0.25%HLC-I支架上構(gòu)建初級(jí)組織工程化血管，再將初級(jí)組織工程化血管埋植于裸鼠皮下進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)動(dòng)態(tài)強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)，探討人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）聯(lián)合 ACVM-0.25%HLC-I支架構(gòu)建組織工程化血管的可行性及裸鼠體內(nèi)作用力對(duì)構(gòu)

42、建的組織工程化血管的影響。
　　方法：
　　1 ACVM-0.25% HLC-I支架材料的制備與處理，實(shí)驗(yàn)方法同第三部分。
　　2 ACVM-0.25%HLC-I支架材料的消毒處理
　　3 EdU Apollo488標(biāo)記誘導(dǎo)形成的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）和血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）及鑒定標(biāo)記率
　　4 EdU Apollo488標(biāo)記血管平滑肌細(xì)胞（ VSMC）并種植于ACVM-0.25%HLC-I支架

43、　　采用多次沉淀法將 EdU Apollo488標(biāo)記的誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）（1×106/ml）種植于ACVM-0.25% HLC-I支架上，連續(xù)培養(yǎng)7天。
　　5 DAPI標(biāo)記誘導(dǎo)形成的血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）及熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記率
　　6凝膠法種植誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）
　　將DAPI標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）與Matrigel基質(zhì)按照4:1的比例混合制備成 VECs-Matrigel凝膠，均勻涂抹

44、于種植有VSMCs-ACVM-0.25% HLC-I支架材料的表面，置于37?C，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，12小時(shí)后加入含15%FBS的1640:L-DMEM＝1:1的培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)3天。
　　7種子細(xì)胞種植支架后HE染色觀察
　　8種子細(xì)胞種植支架后免疫組化染色
　　兔抗人肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體或鼠抗人肌球蛋白（SM-MHC）抗體特異性標(biāo)記ACVM-0.25%HLC-I支架上的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）。鼠抗人

45、CD34抗體和鼠抗人CD31抗體特異性標(biāo)記ACVM-0.25% HLC-I支架表面生長(zhǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）。
　　9種子細(xì)胞種植支架后免疫熒光染色
　　9.1免疫熒光單標(biāo)鑒定
　　Calponin1（Cnn1）蛋白和平滑肌22α（SM22α）蛋白特異性標(biāo)記ACVM-0.25% HLC-I支架表面及內(nèi)部生長(zhǎng)的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC），熒光二抗采用 FITC；血管性假血友病因子（vWF）蛋白和上皮鈣粘附分子（E-ca

46、dherin）蛋白特異性標(biāo)記ACVM-0.25%HLC-I支架表面生長(zhǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC），熒光二抗采用Rhodamine，激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像。
　　9.2免疫熒光雙標(biāo)鑒定
　　一抗采用兔抗人SM22α抗體和鼠抗人vWF抗體或鼠抗人Cnn1抗體和兔抗人 E-cadherin抗體；一抗采用兔抗人α-SMA抗體和鼠抗人CD34抗體或鼠抗人SM-MHC抗體和兔抗人CD31抗體；熒光二抗采用山羊抗鼠 Rhodamine

47、和山羊抗兔 FITC或山羊抗兔 Rodamine和山羊抗鼠 FITC進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)。同時(shí)標(biāo)記ACVM-0.25%HLC-I支架上的兩種細(xì)胞。
　　10掃描電鏡觀察
　　11裸鼠體內(nèi)動(dòng)態(tài)強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)
　　將單純ACVM-0.25% HLC-I支架組和構(gòu)建的血管組植入裸鼠皮下。分別于術(shù)后第3、6、9周再次麻醉動(dòng)物，取出植入皮下的組織進(jìn)行固定，行組織學(xué)觀察，熒光染色觀察和壓力承受實(shí)驗(yàn)測(cè)定。
　　11.1組織學(xué)觀察

48、　　11.2 EdU Apollo488和DAPI熒光染色示蹤細(xì)胞
　　11.3壓力承受實(shí)驗(yàn)測(cè)定
　　實(shí)驗(yàn)分為裸鼠體內(nèi)埋植的單純ACVM-0.25%HLC-I支架組，構(gòu)建的血管組和正常血管組，用注滿生理鹽水的壓力槍進(jìn)行壓力爆破實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1細(xì)胞示蹤標(biāo)記率結(jié)果
　　EdU Apollo488標(biāo)記的誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）和血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）在熒光顯微鏡下可見90%以上的細(xì)胞被標(biāo)記上；經(jīng)D

49、API標(biāo)記的誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）在熒光顯微鏡下可見90%以上的細(xì)胞被標(biāo)記上。
　　2體外構(gòu)建組織工程化血管
　　2.1 HE染色觀察
　　單獨(dú)種植誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）于ACVM-0.25%HLC-I支架時(shí)，可見細(xì)胞在支架材料內(nèi)部及表面均勻生長(zhǎng)；單獨(dú)種植誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）于 Matrigel-ACVM-0.25% HLC-I支架表面時(shí)，細(xì)胞單層排列分布于支架表面；種植兩種細(xì)胞于ACVM-0.2

50、5% HLC-I支架時(shí)可見內(nèi)層為誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）層，中間為Matrigel-VSMCs層，最外層為纖維支架層。
　　2.2免疫組化染色結(jié)果
　　單獨(dú)種植誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）于ACVM-0.25%HLC-I支架時(shí)，細(xì)胞呈α-SMA和SM-MHC抗原陽(yáng)性反應(yīng)。單獨(dú)種植誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）于 Matrigel-ACVM-0.25% HLC-I支架時(shí)，細(xì)胞呈 CD34和CD31抗原陽(yáng)性反應(yīng)。
　　

51、2.3免疫熒光染色結(jié)果
　　2.3.1免疫熒光單標(biāo)結(jié)果
　　單獨(dú)種植誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）于 ACVM-0.25% HLC-I支架時(shí)，Cnn1和SM22α抗原陽(yáng)性反應(yīng)，支架內(nèi)部和表面的細(xì)胞被FITC染成綠色熒光，細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色。單獨(dú)種植誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）于Matrigel-ACVM-0.25% HLC-I支架時(shí)，vWF和E-cadherin抗原陽(yáng)性反應(yīng)，支架表面的細(xì)胞被Rhodamine染成紅色

52、熒光，細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色。
　　2.3.2免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果
　　分層種植于ACVM-0.25%HLC-I支架的種子細(xì)胞中，支架材料內(nèi)部的細(xì)胞SM22α，Cnn1，α-SMA或SM-MHC抗原陽(yáng)性反應(yīng)，胞漿FITC呈綠色熒光表達(dá)，表面的部分細(xì)胞 vWF，E-cadherin，CD34或 CD31抗原陽(yáng)性反應(yīng)，胞漿Rhodamine呈紅色熒光表達(dá)，細(xì)胞核均被DAPI染成藍(lán)色。
　　2.4掃描電鏡觀察結(jié)果
　　結(jié)

53、果顯示，橫斷面尚可見雙層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，內(nèi)表面可見誘導(dǎo)形成的血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）均勻分布且與支架具有良好的生物相容性，細(xì)胞與細(xì)胞之間呈鋪路石樣結(jié)構(gòu)。
　　3裸鼠體內(nèi)動(dòng)態(tài)強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　3.1標(biāo)本大體觀察
　　3周時(shí)，單純支架組和細(xì)胞支架組均位于裸鼠的皮下，周圍有極薄的裸鼠組織包裹，管腔坍塌，管腔中間有少量裸鼠組織長(zhǎng)入；6周時(shí)，管型結(jié)構(gòu)完整，裸鼠組織長(zhǎng)入，使得管壁相對(duì)增厚，管腔中間有裸鼠組織長(zhǎng)入；9周時(shí)，管型結(jié)構(gòu)仍然完整，

54、周圍和中間的裸鼠組織包裹增厚更明顯。
　　3.2組織學(xué)觀察
　　HE染色可見，3周時(shí)，單純支架組管壁結(jié)構(gòu)清晰，周圍有少量纖維組織包繞和少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；細(xì)胞支架組管壁中有大量種植細(xì)胞和少量裸鼠細(xì)胞長(zhǎng)入，周圍有少量纖維組織包繞和大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。6周時(shí)，單純支架組有少量降解，管壁中有裸鼠細(xì)胞長(zhǎng)入，周圍少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；細(xì)胞支架組管壁中有大量細(xì)胞，結(jié)構(gòu)清晰，周圍有纖維組織包繞，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少。9周時(shí)，單純支架組逐漸降解，周圍有大量纖維

55、結(jié)締組織包繞和少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；細(xì)胞支架組管壁仍然十分清晰，管壁中有大量細(xì)胞，大部分來(lái)源于誘導(dǎo)形成的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）和血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC），少數(shù)來(lái)源于裸鼠細(xì)胞的長(zhǎng)入，周圍少量纖維組織包繞，炎細(xì)胞浸潤(rùn)幾乎看不到。
　　3.3 EdU Apollo488和DAPI熒光染色示蹤細(xì)胞結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)組裸鼠皮下植入培養(yǎng)9周后，ACVM-0.25% HLC-I支架上誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）被EdU Apollo488標(biāo)記呈

56、綠色熒光，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）被EdU Apollo488標(biāo)記呈綠色熒光，同時(shí)被DAPI標(biāo)記呈藍(lán)色熒光，證實(shí)這些細(xì)胞來(lái)源于之前種植于支架的種子細(xì)胞。
　　3.4壓力承受實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果
　　ACVM-0.25%HLC-I支架組與組織工程化血管組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ P<0.05）；組織工程化血管組與正常血管組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）
　　結(jié)論：
　　1人牙齦成纖維細(xì)胞（ HGFs）能在體外誘導(dǎo)分化為

57、血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）。
　　2人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）能在體外誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）。
　　3類人 I型膠原蛋白（HLC-I）與兔脫細(xì)胞血管基質(zhì)（ACVM）聯(lián)合制備的 ACVM-0.25%HLC-I支架材料具備充分的促進(jìn)細(xì)胞粘附，細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移能力以及良好的機(jī)械性和生物力學(xué)性能。
　　4人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）誘導(dǎo)分化為血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）和血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC），分層種植于ACVM-