骨碎補對人牙齦成纖維細胞增殖分化的實驗研究.pdf

1、目的：本實驗通過體外原代培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞，在倒置顯微鏡下觀察該細胞形態(tài)及生長方式，檢測中藥骨碎補對牙齦成纖維細胞的增殖活性及細胞總蛋白合成的影響，為今后中藥骨碎補用于臨床治療牙齦及牙周疾病提供實驗依據(jù)。 方法：采用組織塊法培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞，在倒置相差顯微鏡及光鏡下觀察其細胞形態(tài)。制備中藥骨碎補煎液，用MTT法和考馬斯亮藍染色法分別測定藥物作用下細胞的生長曲線及總蛋白合成等基本生物學特性，檢測中藥骨碎補對體外培養(yǎng)的人牙齦成

2、纖維細胞的增殖活性及細胞總蛋白合成的影響。 1牙齦成纖維細胞的原代培養(yǎng)及生物學特性觀察：河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院口腔科拔除的阻生健康牙齒上，切取少量牙齦組織，將所取的牙齦組織立即放置于含有青霉素100u/ml、100μg/ml鏈霉素的預冷Hank's液中。采用組織塊法培養(yǎng)人牙齦成纖維細胞。取第4代細胞胰酶消化，制成細胞懸液，調整細胞濃度至1×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板。每24h取3孔，吸棄培養(yǎng)液，胰酶消化，制成細胞懸液，計數(shù)，

3、取均值。連續(xù)觀察7d，繪制牙齦成纖維細胞的生長曲線。 2骨碎補煎液的制備：自河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院中藥房購買中藥骨碎補，將骨碎補加入水中煎煮，過濾，用含2％FBS的培養(yǎng)液稀釋到10，50，100，500，1000μg/ml的終濃度，調pH至7.0～7.1，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?3細胞增殖效應和細胞總蛋白含量的測定：取第4代細胞胰酶消化，制成細胞懸液，調整細胞濃度至1×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，孵育2

4、4h后吸棄培養(yǎng)液。分別將濃度不同的中藥骨碎補煎液加入到培養(yǎng)2，5，8d的牙齦成纖維細胞液中，MTT法及考馬斯亮藍染色法測定骨碎補作用后的人牙齦成纖維細胞的增殖效應和細胞總蛋白含量。 結果： 1牙齦成纖維細胞形態(tài)學觀察：牙齦成纖維細胞體外原代培養(yǎng)成功率為100％，倒置顯微鏡下牙齦成纖維細胞呈長梭形或紡錘形，為單核細胞，有長短不一的細胞突起，細胞核為圓形或卵圓形，大多位于胞漿中央，細胞排列呈束狀或漩渦狀。HE染色光鏡下觀察胞

5、質豐滿，嗜伊紅，胞核嗜堿性。 2人牙齦成纖維細胞的生長曲線：生長曲線略呈“S”形，接種后第1d細胞數(shù)略有下降，第2d開始有所回升，但長勢緩慢。第3d開始曲線急劇上升，提示細胞生長速度加快，進入對數(shù)生長期，這一狀態(tài)持續(xù)至第5d。第6d開始進入平臺期，細胞生長速度減緩。 3骨碎補對細胞的增殖效應：10、50、100、500、1000μg/ml范圍內(nèi)各濃度中藥骨碎補組的牙齦成纖維細胞生長速度均高于對照組，骨碎補煎液在濃度為10

6、0μg/ml時對人牙齦成纖維細胞增殖效果最為顯著。隨著作用時間的延長，細胞的OD值逐漸增大，在第5天達到最大。不同作用時間組之間具有明顯的差異(P＜0.05)，在10、50、100、500、1000μg/ml范圍內(nèi)，骨碎補促增殖作用，顯示出一個明顯的濃度依賴效應和時間依賴效應。 4骨碎補對人牙齦成纖維細胞總蛋白合成的影響：10、50、100、500、1000μg/ml的骨碎補與對照組比較均明顯促進人牙齦成纖維細胞總蛋白合成(P＜

7、0.05)，且骨碎補對人牙齦成纖維細胞總蛋白合成的促進作用顯示出明顯的濃度依賴效應。 結論： 1牙齦成纖維細胞體外原代培養(yǎng)成功率較高，可為牙齦及牙周病的研究提供大量的種子細胞。 2骨碎補提取液在10、50、100、500、1000μg/ml濃度范圍內(nèi)，細胞接種2～,8天內(nèi)有促進人牙齦成纖維細胞增殖的作用，其中細胞接種第5天，100μg/ml濃度的骨碎補對人牙齦細胞增殖效果最為顯著。 310、50、100、