柯薩奇病毒B-,3-對培養(yǎng)大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣通道功能與表達(dá)的影響.pdf

1、[研究背景與目的] 心肌炎是由多種病因引起的心肌的炎癥性疾病，最常見的原因?yàn)椴《靖腥荆渲幸阅c道病毒包括柯薩奇A，B組病毒，孤兒病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒等為常見，尤其是柯薩奇B組病毒。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)急性心肌炎病人在病毒感染后3周內(nèi)會(huì)出現(xiàn)心電圖的異常，包括ST-T改變和各型心律失常，特別是室性心律失常尤為常見，但是其確切的心電生理或分子機(jī)制尚不明確。故本研究通過構(gòu)建柯薩奇病毒B3感染大鼠心室肌細(xì)胞模型，觀察該病毒對新生大鼠心室肌細(xì)胞形

2、態(tài)及結(jié)構(gòu)的影響，了解病毒對心室肌細(xì)胞的直接損傷作用；記錄感染柯薩奇病毒B3后心室肌細(xì)胞L型鈣電流的變化，探討病毒性心肌炎室性心律失常發(fā)生的細(xì)胞電生理機(jī)制；檢測柯薩奇病毒B3感染培養(yǎng)大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣通道各亞單位mRNA及蛋白的表達(dá)，探討病毒性心肌炎室性心律失常發(fā)生的分子機(jī)制，以期為臨床上對病毒性心肌炎心律失常發(fā)病機(jī)制的理解及其治療提供新的思路。 [方法] (1)回顧性分析127例病毒性心肌炎患者的心電圖表現(xiàn)，觀察各類心

3、律失常的發(fā)生情況； (2)構(gòu)建病毒性心肌炎的細(xì)胞感染模型：取1～3日齡新生SD大鼠進(jìn)行心室肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，用柯薩奇病毒B3Nancy株感染培養(yǎng)48小時(shí)已呈規(guī)律搏動(dòng)的心室肌細(xì)胞，觀察病毒感染前后細(xì)胞形態(tài)、搏動(dòng)百分比和超微結(jié)構(gòu)改變，監(jiān)測培養(yǎng)液上清中肌酸激酶濃度的改變，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測感染細(xì)胞及其上清液中是否存在病毒RNA。 (3)電生理試驗(yàn)：感染病毒24小時(shí)，細(xì)胞尚未出現(xiàn)明顯病變時(shí)，取正常組和病毒感染組心室肌細(xì)胞，采

4、用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分別記錄兩組細(xì)胞的L-型鈣電流，觀察病毒感染前后細(xì)胞膜電容，電流密度，電壓依賴性激活和失活等動(dòng)力學(xué)參數(shù)的改變。 (4)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)：同批培養(yǎng)的心室肌細(xì)胞接種柯薩奇病毒B3后，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，測量病毒感染前后L型鈣通道各亞單位mRNA表達(dá)量的變化。 (5)抗體的制備、純化以及免疫印跡：采用固相合成法合成心肌細(xì)胞L型鈣通道各亞單位的肽段，免疫動(dòng)物，分離血清，經(jīng)鑒定后采用飽和硫酸銨鹽析提純制

5、備得到抗-大鼠心室肌細(xì)胞L型鈣通道各亞單位的多克隆抗體，采用免疫印記技術(shù)測量病毒感染前后L型鈣通道各亞單位蛋白表達(dá)量的變化。 [結(jié)論] (1)病毒性心肌炎可導(dǎo)致各種心律失常的發(fā)生，其中以室性心律失常最為常見； (2)柯薩奇病毒B3感染對體外培養(yǎng)的心室肌細(xì)胞可以產(chǎn)生直接的損傷作用，因而可作為體外研究病毒性心肌炎的細(xì)胞模型；該病毒感染心室肌細(xì)胞后使細(xì)胞膜L型鈣電流明顯增大，L型鈣通道功能性α1c亞單位和調(diào)節(jié)性β2亞單